Análise da expressão global de Gene usando uma plataforma Microarray Zebrafish Oligonucleotide

Resumo

Gene microarrays são ferramentas poderosas no perfil de expressão gênica ao nível do genoma. Esta tecnologia tem aplicação em uma variedade de disciplinas biológicas, incluindo biologia do desenvolvimento e toxicologia. Neste vídeo, detalhamos um protocolo para análise global de expressão gênica utilizando uma plataforma de microarray abrangente de oligonucleotídeos para o peixe-zebra.

Resumo

Gene microarray tecnologia permite a medição quantitativa e perfil de expressão gênica dos níveis de transcrição em uma base de todo o genoma. Gene microarray tecnologia é utilizada em numerosas disciplinas biológicas em uma variedade de aplicações, incluindo análise global de expressão gênica em relação ao estágio de desenvolvimento, para um estado de doença, e em respostas tóxicas. Aqui, nós incluímos uma demonstração de análise global de expressão gênica utilizando um abrangente zebrafish específicos plataforma de microarranjos de oligonucleotídeos. O peixe-zebra plataforma de microarray expressão contém 385.000 sondas, 60 pares de bases de comprimento, interrogando 37.157 alvos com até 12 sondas por alvo. Para esta plataforma, todas as informações de cDNA e genômica disponível para o peixe-zebra foi coletado a partir de bases de dados genômicos diversos, incluindo Ensembl (http://www.ensembl.org), VEGA (http://vega.sanger.ac.uk), UCSC ( http://genome.ucsc.edu), e ZFIN (http://www.zfin.org). Como resultado dessa matriz de expressão fornece cobertura completa do transcriptoma zebrafish atual. O microarray expressão zebrafish foi impresso pela Roche NimbleGen (Madison, WI). Esta demonstração técnica inclui a marcação fluorescente de um produto cDNA, hibridação do produto marcado para a plataforma de cDNA microarray, e digitalização de matriz para a aquisição de sinal usando a estratégia de uma análise de cor.

Protocolo

Parte 1: Marcação Fluorescente de cDNA

O corante Cy3 utilizado no experimento de microarranjo é sensível à fotodegradação. O procedimento deve ser realizado com a menor quantidade possível de luz. O protocolo de marcação foi adaptado do Manual do Sistema de Marcação Genômica BioPrime Array CGH¹.

1. Os reagentes para a reação de marcação são armazenados a -20°C. Do sistema de marcação genômica BioPrime Array CGH, descongele o tampão de iniciadores aleatórios 2,5X, a mistura de dCTP 10X e a água livre de nucleases. Também descongele o corante Cy3-dCTP. Após o descongelamento, centrifugue brevemente todos os reagentes antes de usá-los.
2. Uma reação de marcação separada deverá ser realizada para cada amostra de cDNA a ser analisada. Em um tubo de parede grossa de 0,6 ml, adicione 500 ng de cDNA, 40 μl de tampão de iniciadores aleatórios 2,5X e água livre de nucleases para atingir um volume total de 86 μl.
3. Homogeneíze bem e centrifugue brevemente. Incube a reação por 5 minutos a 100°C em um termociclador.
4. Transfira imediatamente a reação para uma banho de gelo por 10 minutos.
5. Em seguida, adicione a cada tubo 10 μl da mistura de dCTP 10X, 2 μl de Cy3-dCTP 1 mM e 2 μl da polimerase de DNA Exo Klenow. A polimerase de DNA Exo Klenow deve permanecer no congelador até o momento do uso e sempre deve ser mantida sob gelo.
6. Homogeneíze bem a reação e centrifugue brevemente.
7. Incube a reação a 37°C por 16 horas em um termociclador.

Parte 2: Precipitação do cDNA Marcado

1. Antes de prosseguir com o protocolo, ligue o Sistema de Hibridização NimbleGen e deixe o sistema equilibrar a 42°C.
2. Para cada reação, coloque uma coluna Microcon em um tubo de 1,5 ml. Adicione 300 μl de SSC 0,1X a cada coluna, seguido do conteúdo da reação de marcação (100 μl).
3. Centrifugue o tubo contendo a coluna a 16.100 x g durante 10 minutos a 4°C.
4. Descarte o fluxo passante, que pode ter uma coloração levemente rosada, e adicione outros 300 μl de SSC 0,1X à coluna.
5. Repita a centrifugação a 16.100 x g durante 10 minutos a 4°C.
6. Descarte o fluxo passante e adicione mais 300 μl de SSC 0,1X à coluna.
7. Centrifugue a 16.100 x g durante 12 minutos a 4°C.
8. Descarte o fluxo passante. O fluxo passante deve estar claro após esta última lavagem, e você deverá ser capaz de ver o cDNA marcado em rosa na coluna.
9. Adicione 100 μl de água livre de nucleases à coluna. Remova a coluna do tubo de 1,5 ml e inverta a coluna em um novo tubo de 1,5 ml.
10. Centrifugue a 2.300 x g durante 2 minutos a 4°C. O cDNA marcado deverá ser reidratado na água que se acumula no fundo do tubo.
11. Utilize um espectrofotômetro NanoDrop ND-1000 conforme as instruções do fabricante para calcular a concentração de DNA e avaliar a incorporação do corante calculando a razão base/corante, onde a razão nucleotídeo/Cy3 equivale à razão A₂₆₀/A₅₅₀ multiplicada por 23,15. A razão base/corante deve estar entre 50 e 80.
12. Se o cDNA estiver suficientemente marcado, alíquota 6 μg de cDNA marcado em um novo tubo de 1,5 ml.
13. Adicione 0,1 volume de NaOAc 3 M, pH 5,2, e 1 volume de isopropanol. Deixe a mistura incubar no escuro por 30 minutos à temperatura ambiente.
14. Em seguida, centrifugue a amostra a 16.100 x g durante 20 minutos à temperatura ambiente.
15. Descarte cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o pellet de DNA, que deve ser rosado.
16. Realize uma lavagem com etanol adicionando 500 μl de EtOH 70% e misture por inversão suave.
17. Centrifugue a amostra a 16.100 x g durante 5 minutos à temperatura ambiente.
18. Remova o sobrenadante, inverta o tubo e deixe o pellet secar por 5 minutos. Neste passo, o pellet pode ser armazenado a -20°C, se desejado, ou o protocolo pode prosseguir para a etapa de hibridização.

Parte 3: Hibridização

O procedimento de hibridização é adaptado do Guia do Usuário de Matrizes Roche NimbleGen para Análise de Expressão Gênica².

1. Dissolva o pellet em 5 μl de água livre de nucleases.
2. Uma vez que o pellet esteja dissolvido, adicione os componentes de hibridização listados na Tabela 1. Os componentes de hibridização são do Kit de Hibridização Roche NimbleGen. Após a adição de todos os componentes, o volume total deve atingir 18 μl. Misture bem e centrifugue brevemente o tubo para recolher o conteúdo no fundo.
3. O próximo passo é desnaturar o cDNA marcado colocando-o em um bloco térmico a 95°C por 5 minutos.
4. Transfira imediatamente o tubo para o Sistema de Hibridização NimbleGen enquanto os arranjos forem preparados nos passos seguintes.
5. Os microarranjos devem sempre ser manipulados com cuidado e armazenados de acordo com as instruções do fabricante. A Roche NimbleGen recomenda armazenar seus arranjos de expressão no escuro, com dessecante, à temperatura ambiente.
6. Carregue o arranjo na Ferramenta de Alinhamento do Misturador de Precisão (PMAT) fornecida nos acessórios para processamento de arranjos NimbleGen.
7. Coloque um misturador X1 na PMAT e remova a tira adesiva com pinça. Feche a PMAT com segurança. Aplique pressão sobre o misturador através do orifício na PMAT e abra lentamente para que o arranjo e o misturador se soltem da PMAT.
8. Aplique firmemente pressão com o rolo ao redor da parte externa do misturador para garantir que o selo com o arranjo esteja completo e para remover quaisquer bolhas de ar. Coloque o conjunto arranjo-misturador no sistema de hibridização para aquecimento.
9. Usando uma pipeta de deslocamento, adicione lentamente 15 μl da amostra marcada na porta de preenchimento. Este é o orifício localizado no centro do misturador. Aplique pressão lenta e constante na pipeta para que a amostra se espalhe uniformemente pelo misturador sem formar bolhas de ar. Limpe qualquer excesso de amostra dos orifícios e feche os orifícios com tiras adesivas.
10. Feche a trava e inicie a mistura da solução de hibridização usando o programa B no Sistema de Hibridização NimbleGen. Deixe os microarranjos hibridizarem por 16 a 20 horas.

Parte 4: Lavagens Pós-hibridização e Escaneamento de Microarranjo

O procedimento de lavagem e digitalização é adaptado do Guia do Usuário de Matrizes Roche NimbleGen para Análise de Expressão Gênica².

1. Quando a hibridização estiver quase concluída, prepare os tampões de lavagem conforme descrito na Tabela 2. Pré-aqueça o Tampão de Lavagem IA a 42°C em banho-maria.
2. Ligue o scanner de matrizes GenePix 4000B e aguarde cerca de 15 minutos para que o equipamento aqueça antes do uso.
3. Despeje o Tampão de Lavagem IA pré-aquecido em um recipiente.
4. Remova o complexo matriz-misturador do sistema de hibridização NimbleGen e deslize-o para dentro do suporte (fornecido nos acessórios para processamento de matrizes NimbleGen). Mergulhe o conjunto no Tampão de Lavagem IA pré-aquecido e remova cuidadosamente o misturador, puxando-o para longe da lâmina.
5. Retire a matriz do suporte e agite por 15 segundos no Tampão de Lavagem IA.
6. Transfira rapidamente a matriz para uma grade de lâminas contendo o Tampão de Lavagem IB em temperatura ambiente. Agite a grade vigorosamente por 2 minutos.
7. Transfira a grade para o Tampão de Lavagem II e agite por 1 minuto.
8. Transfira a grade para o Tampão de Lavagem III e agite por 15 segundos.
9. Transfira a matriz para a centrífuga de secagem de lâminas e gire por 2 minutos para remover toda a umidade. Prossiga para a etapa de digitalização.
10. Recomenda-se digitalizar a matriz imediatamente, pois o corante é sensível à luz e ao ozônio.
11. Carregue a matriz no scanner de matrizes GenePix 4000B com o código de barras voltado para baixo.
12. Abra o software GenePix Pro e prossiga com a digitalização da matriz. As matrizes de expressão gênica Roche NimbleGen utilizam uma estratégia de hibridização com um único corante. Como resultado, apenas um comprimento de onda é necessário para a digitalização. Digitalize o sinal de fluorescência Cy3 utilizando o laser de 532 nm. Abra a caixa de diálogo de configurações de hardware e defina o valor do PMT do laser de 532 nm para 500.
13. Na caixa de diálogo de configurações de hardware, defina a potência em 100%, o tamanho do pixel em 5 micrômetros, o número de linhas para média em 1 e a posição de foco em 0 micrômetro.
14. Realize uma pré-visualização da digitalização e defina a área de varredura.
15. Execute a digitalização.
16. Após a conclusão da digitalização, verifique o histograma da imagem. Idealmente, contagens normalizadas de 1e-5 devem atingir o limite de saturação de 65.000, o que significa que cerca de 1-2% das características estão saturadas. Se as contagens normalizadas forem inferiores a 1e-5, aumente o ganho do PMT e digitalize novamente a lâmina. Se as contagens normalizadas forem superiores a 1e-5, reduza o ganho do PMT e digitalize novamente a lâmina.
17. Após a conclusão da digitalização, salve a imagem. Recomenda-se adotar uma convenção padrão de nomenclatura para as imagens, facilitando sua referência. A imagem pode agora ser carregada no programa de análise de dados de preferência para normalização dos dados e cálculo dos valores de intensidade.

Resultados Representativos

Você pode começar a avaliar a eficiência da reação de marcação com fluorescência Cy3 do cDNA ao iniciar as lavagens com SSC 0,1X. Em cada lavagem subsequente, o eluato deve ficar menos rosado, sendo transparente na última lavagem. Além disso, o produto de cDNA marcado com Cy3 deve ser visível na coluna durante essas etapas de lavagem. Se o eluato for intensamente rosado ou não houver produto cor-de-rosa na coluna, isso é um bom indicativo de que a reação de marcação não ocorreu corretamente. A reação de marcação pode ser avaliada quantitativamente utilizando o espectrofotômetro NanoDrop ND-1000 para determinar a concentração do DNA marcado e a razão base/corante (Figura 1). Normalmente, a reação de marcação produz pelo menos 10 μg de DNA marcado em nosso laboratório. A incorporação do corante pode ser calculada por meio de uma simples razão base/corante, na qual a razão nucleotídeo/Cy3 é igual à razão A₂₆₀/A₅₅₀ multiplicada por 23,15. Valores entre 50 e 80 indicam incorporação suficiente de corante na reação de marcação. Se a reação de marcação resultar em baixa concentração de DNA ou má incorporação do corante, não é recomendado hibridizar a amostra no microarranjo e a reação de marcação deve ser repetida.

A avaliação da qualidade da hibridização pode ser realizada mediante análise do histograma da imagem e da imagem escaneada do micromatriz (Figura 2). Hibridizações aceitáveis apresentarão 1-2% das características saturadas (ou seja, com contagens normalizadas de 1e-5 no limite de saturação de 65.000), com o valor de PMT ajustado próximo a 500. Se o valor de PMT precisar ser ajustado drasticamente a partir de 500 para atingir contagens normalizadas de 1e-5 no limite de saturação de 65.000, isso geralmente indica uma hibridização inadequada do cDNA marcado à micromatriz. A qualidade dos dados será comprometida se esses dados forem utilizados em análises subsequentes. A qualidade da hibridização também pode ser avaliada qualitativamente pela visualização das imagens do arranjo escaneado (Figura 3). O Kit de Hibridização Roche NimbleGen contém uma mistura de oligonucleotídeos de alinhamento marcados com Cy3 e Cy5, com 48 nucleotídeos de comprimento, que hibridizam com características de alinhamento nas micromatrizes. A avaliação qualitativa da intensidade dos oligonucleotídeos de alinhamento em relação a outras características na micromatriz permite uma verificação da eficiência da hibridização do cDNA marcado fluorescentemente à micromatriz. Após análises adicionais, um gráfico de dispersão dos dados analisados pode ser utilizado para determinar os níveis relativos de expressão gênica e identificar genes que são diferencialmente expressos entre as amostras (Figura 4).

Figura 1. Um espectro NanoDrop de cDNA marcado com Cy3. O rendimento de cDNA marcado e a incorporação do corante podem ser avaliados utilizando um espectrofotômetro NanoDrop ND-1000. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior da figura 1.

Figura 2. Um histograma GenePix para varredura de microarranjo. A qualidade da hibridização pode ser avaliada mediante a análise do histograma da imagem. Hibridizações aceitáveis apresentarão 1-2% das características saturadas com contagens normalizadas de 1e-5 no limite de saturação de 65.000, com o valor de PMT ajustado próximo a 500. Clique aqui para ver uma versão maior da figura 2.

Figura 3. Imagem escaneada de um microarranjo. A qualidade da hibridização pode ser avaliada pela visualização da imagem escaneada do microarranjo. A imagem deve ser examinada quanto à presença de poeira ou outros fatores interferentes que impeçam a visualização de cada elemento e, consequentemente, impeçam o cálculo preciso da intensidade de fluorescência do elemento. A intensidade dos oligonucleotídeos de alinhamento pode ser comparada com a dos outros elementos no arranjo para avaliar a eficiência de hibridização.

Figura 4. Um gráfico de dispersão de um experimento de microarranjo analisado. O objetivo deste procedimento é identificar genes que são diferencialmente expressos nas suas amostras. Os dados de microarranjo podem ser analisados e visualizados adicionalmente em um gráfico de dispersão para evidenciar genes que são diferencialmente expressos.

Tabela 1. Componentes do Kit de Hibridização Roche NimbleGen a adicionar para a etapa 2 de hibridização.

Componente	Volume
Amostra (dissolvida em água)	5 μl
Tampão de hibridização 2X	9 μl
Hyb A	3,6 μl
Oligo de alinhamento	0,4 μl
Volume total	18 μl

Tabela 2. Tampões de lavagem a serem preparados para a lavagem das matrizes após hibridização.

Componente	Tampão de Lavagem IA*	Tampão de Lavagem IB	Tampão de Lavagem II	Tampão de Lavagem III
Água	225 ml	225 ml	225 ml	225 ml
Tampão de Lavagem 10X I, II ou III	25 ml	25 ml	25 ml	25 ml
DTT 1 M	25 μl	25 μl	25 μl	25 μl
Volume total	250 ml	250 ml	250 ml	250 ml

*Aquecer previamente a 42°C

Discussão

Protocolos microarray muitos, incluindo o detalhado aqui, use corantes fluorescentes como meio de medir e quantificar a hibridização. O corante fluorescente Cy3 é sensível a foto e degradação de ozônio. Recomenda-se que o procedimento seja realizado em uma iluminação mínima. Além disso, pequenas partículas de poeira pode interferir com a hibridação e digitalização. Especial atenção deve ser dada para garantir que a área de trabalho está limpo e livre de poeira.

Há muitas alternativas para o ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Secador de Microcentrífuga em Array	ISC Bioexpress	C-1303-T
Sistema de Rotulagem Genômica BioPrime Array CGH	Invitrogen	18095-011
Citina 3-dCTP	PerkinElmer, Inc.	NEL576
GenePix 4000B	Molecular Devices	GENEPIX 4000B
Microcon YM-30	EMD Millipore	42411
Acessórios para Processamento de Array NimbleGen	Roche Group	5223539001
Kit de Hibridização NimbleGen	Roche Group	5223474001
Sistema de Hibridização NimbleGen 4	Roche Group	5223652001
Kit de Tampão de Lavagem NimbleGen	Roche Group	5223504001
Misturadores X1	Roche Group	5223725001