Análise da expressão global de Gene usando uma plataforma Microarray Zebrafish Oligonucleotide

Summary

Gene microarrays são ferramentas poderosas no perfil de expressão gênica ao nível do genoma. Esta tecnologia tem aplicação em uma variedade de disciplinas biológicas, incluindo biologia do desenvolvimento e toxicologia. Neste vídeo, detalhamos um protocolo para análise global de expressão gênica utilizando uma plataforma de microarray abrangente de oligonucleotídeos para o peixe-zebra.

Abstract

Gene microarray tecnologia permite a medição quantitativa e perfil de expressão gênica dos níveis de transcrição em uma base de todo o genoma. Gene microarray tecnologia é utilizada em numerosas disciplinas biológicas em uma variedade de aplicações, incluindo análise global de expressão gênica em relação ao estágio de desenvolvimento, para um estado de doença, e em respostas tóxicas. Aqui, nós incluímos uma demonstração de análise global de expressão gênica utilizando um abrangente zebrafish específicos plataforma de microarranjos de oligonucleotídeos. O peixe-zebra plataforma de microarray expressão contém 385.000 sondas, 60 pares de bases de comprimento, interrogando 37.157 alvos com até 12 sondas por alvo. Para esta plataforma, todas as informações de cDNA e genômica disponível para o peixe-zebra foi coletado a partir de bases de dados genômicos diversos, incluindo Ensembl (http://www.ensembl.org), VEGA (http://vega.sanger.ac.uk), UCSC ( http://genome.ucsc.edu), e ZFIN (http://www.zfin.org). Como resultado dessa matriz de expressão fornece cobertura completa do transcriptoma zebrafish atual. O microarray expressão zebrafish foi impresso pela Roche NimbleGen (Madison, WI). Esta demonstração técnica inclui a marcação fluorescente de um produto cDNA, hibridação do produto marcado para a plataforma de cDNA microarray, e digitalização de matriz para a aquisição de sinal usando a estratégia de uma análise de cor.

Protocol

Parte 1: Marcação fluorescente de cDNA

O corante Cy3 usado no experimento de microarray é sensível à fotodegradação. O procedimento deve ocorrer com o mínimo de luz. O protocolo de marcação foi adaptado do BioPrime Array CGH Genomic Labeling System Manual¹.

1. Os reagentes para a reação de marcação são armazenados a -20°C. Do Sistema de Marcação Genômica BioPrime Array CGH, descongele o tampão de primer aleatório 2,5X, mistura de 10X dCTP e água livre de nuclease. Descongele também o corante Cy3-dCTP. Após o descongelamento, centrifugue brevemente todos os reagentes antes de usar.
2. Uma reação de marcação separada precisará ser concluída para cada amostra de cDNA a ser analisada. Em um tubo de parede espessa de 0,6 ml, adicione 500 ng de cDNA, 40 μl de tampão de primer aleatório 2,5X e água livre de nuclease para atingir um volume total de 86 μl.
3. Misture bem e centrifugue brevemente. Incube a reação por 5 minutos a 100 ° C em um termociclador.
4. Transfira imediatamente a reação para uma pasta de banho de gelo por 10 minutos.
5. Em seguida, adicione 10 μl de mistura de 10X dCTP, 2 μl de 1 mM de Cy3-dCTP e 2 μl de DNA polimerase Exo Klenow. A DNA polimerase Exo Klenow deve ser deixada no freezer até que seja necessária e deve ser sempre mantida no gelo.
6. Misture bem a reação e centrifugue brevemente.
7. Incubar a reação a 37°C por 16 horas em um termociclador.

Parte 2: Precipitação de cDNA marcado

1. Antes de continuar no protocolo, ligue o Sistema de Hibridização NimbleGen e permita que o sistema se equilibre a 42°C.
2. Para cada reação, coloque uma coluna Microcon em um tubo de 1,5 ml. Adicione 300 μl de SSC 0,1X a cada coluna, seguido pelo conteúdo da reação de marcação (100 μl).
3. Centrifugue o tubo que contém a coluna a 16.100 x g por 10 minutos a 4°C.
4. Descarte o fluxo, que pode ser ligeiramente rosado, e adicione mais 300 μl de SSC 0,1X à coluna.
5. Repita a centrifugação a 16.100 x g por 10 minutos a 4 ° C.
6. Descarte o fluxo e adicione mais 300 μl 0,1X SSC à coluna.
7. Centrifugue a 16.100 x g por 12 minutos a 4 ° C.
8. Descarte o fluxo. O fluxo deve ser claro após esta última lavagem e você deve ser capaz de ver o cDNA rotulado em rosa na coluna.
9. Aplique 100 μl de água livre de nuclease na coluna. Remova a coluna do tubo de 1,5 ml e inverta a coluna em um novo tubo de 1,5 ml.
10. Centrifugue a 2.300 x g por 2 minutos a 4°C. O cDNA marcado deve ser reidratado na água que se acumula no fundo do tubo.
11. Use um espectrofotômetro NanoDrop ND-1000 de acordo com as instruções do fabricante para calcular a concentração de DNA e avaliar a incorporação do corante calculando a proporção de base para corante onde a proporção de nucleotídeo para Cy3 é igual à proporção A₂₆₀/A₅₅₀ multiplicada por 23,15. A proporção de base para corante deve estar entre 50 e 80.
12. Se o cDNA for marcado o suficiente, alíquota de 6 μg de cDNA marcado em um novo tubo de 1,5 ml.
13. Misture 0,1X volume de 3 M NaOAc, pH 5,2 e 1X volume de isopropanol. Deixe a mistura incubar no escuro por 30 minutos em temperatura ambiente.
14. Em seguida, centrifugue a amostra a 16.100 x g por 20 minutos à temperatura ambiente.
15. Descarte cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o pellet de DNA, que deve ser de cor rosa.
16. Efectuar uma lavagem com etanol adicionando 500 μl de EtOH a 70% e misturar por inversão suave.
17. Centrifugue a amostra a 16.100 x g por 5 minutos em temperatura ambiente.
18. Remova o sobrenadante, inverta o tubo e deixe o pellet secar por 5 minutos. Nesta etapa, o pellet pode ser armazenado a -20°C, se desejado, ou o protocolo pode ser continuado até a etapa de hibridização.

Parte 3: Hibridização

O procedimento de hibridização é adaptado do Guia do Usuário do Roche NimbleGen Arrays para Análise de Expressão Gênica².

1. Dissolver o sedimento em 5 μl de água isenta de nuclease.
2. Depois que o pellet estiver dissolvido, adicione os componentes de hibridização listados na Tabela 1. Os componentes de hibridização são do kit de hibridização NimbleGen da Roche. Depois que todos os componentes forem adicionados, o volume total deve totalizar 18 μl. Misture bem e gire brevemente o tubo para coletar o conteúdo na parte inferior.
3. O próximo passo é desnaturar o cDNA marcado, colocando-o em um bloco de calor a 95 ° C por 5 minutos.
4. Transfira imediatamente o tubo para o Sistema de Hibridização NimbleGen enquanto as matrizes são preparadas nas etapas a seguir.
5. Os microarrays devem sempre ser manuseados com cuidado e armazenados de acordo com as instruções do fabricante. A Roche NimbleGen recomenda armazenar suas matrizes de expressão no escuro com dessecante em temperatura ambiente.
6. Carregue a matriz na Ferramenta de Alinhamento do Mixer de Precisão (PMAT) fornecida nos acessórios de processamento da matriz NimbleGen.
7. Carregue um misturador X1 no PMAT e remova a fita adesiva com uma pinça. Feche o PMAT com segurança. Aplique pressão no misturador através do orifício no PMAT e abra lentamente para que a matriz e o misturador se soltem do PMAT.
8. Aplique pressão firmemente com o brayer ao redor da parte externa do misturador para garantir que a vedação da matriz esteja completa e para remover quaisquer bolhas. Coloque o complexo misturador de matriz no sistema de hibridização para aquecer.
9. Usando uma pipeta de deslocamento, adicione lentamente 15 μl da amostra rotulada na porta de enchimento. Este é o orifício localizado no centro do misturador. Aplique pressão lenta e constante na pipeta para que a amostra se espalhe uniformemente pelo misturador sem bolhas de ar. Limpe qualquer excesso de sample dos orifícios da porta e vede os orifícios da porta com fitas adesivas.
10. Feche a trava e comece a misturar a solução de hibridização usando o programa B no sistema de hibridização NimbleGen. Permita que os microarrays hibridizem por 16 a 20 horas.

Parte 4: Lavagens pós-hibridização e varredura de microarray

O procedimento de lavagem e digitalização é adaptado do Guia do Usuário do Roche NimbleGen Arrays para Análise de Expressão Gênica².

1. Quando a hibridização estiver quase concluída, prepare os tampões de lavagem conforme descrito na Tabela 2. Tampão de lavagem pré-aquecido IA a 42 ° C em banho-maria.
2. Ligue o scanner de matriz GenePix 4000B e deixe o scanner aquecer por cerca de 15 minutos antes de usar.
3. Despeje o tampão de lavagem IA pré-aquecido em um prato.
4. Remova o complexo misturador de matriz do sistema de hibridização NimbleGen e deslize para dentro do gabarito (fornecido nos acessórios de processamento de matriz NimbleGen). Mergulhe o conjunto no tampão de lavagem IA pré-aquecido e remova cuidadosamente o misturador, retirando-o da corrediça.
5. Remova a matriz do gabarito e agite por 15 segundos no tampão de lavagem IA.
6. Transfira rapidamente a matriz para um suporte de lâminas em temperatura ambiente Wash Buffer IB. Agite vigorosamente o suporte de slides por 2 minutos.
7. Transfira o rack deslizante para o tampão de lavagem II e agite por 1 minuto.
8. Transfira o rack deslizante para o tampão de lavagem III e agite por 15 segundos.
9. Transfira a matriz para a centrífuga de secagem de lâminas e gire por 2 minutos para remover toda a umidade. Prossiga para a digitalização.
10. Recomenda-se escanear a matriz imediatamente, pois o corante é sensível à luz e ao ozônio.
11. Carregue a matriz, com código de barras para baixo, no scanner de matriz GenePix 4000B.
12. Abra o software GenePix Pro e prossiga para a varredura da matriz. As matrizes de expressão gênica NimbleGen da Roche utilizam uma estratégia de hibridização de uma cor. Como resultado, apenas um comprimento de onda é necessário para a digitalização. Varra o sinal de fluorescência Cy3 usando o laser de 532 nm. Abra a caixa de diálogo de configuração de hardware e defina o valor PMT do laser de 532 nm para um valor de 500.
13. Na caixa de diálogo de configuração de hardware, defina a potência como 100%, o tamanho do pixel como 5 mícrons, as linhas como média como 1 e a posição do foco como 0 mícrons.
14. Execute uma verificação de visualização e defina a área de verificação.
15. Execute a verificação.
16. Quando a digitalização estiver concluída, verifique o histograma da imagem. Idealmente, as contagens normalizadas de 1e-5 devem estar no limite de saturação de 65.000, o que significa que ~ 1-2% dos recursos estão saturados. Se as contagens normalizadas forem menores que 1e-5, aumente o ganho de PMT e escaneie novamente o slide. Se as contagens normalizadas forem maiores que 1e-5, diminua o ganho de PMT e verifique novamente o slide.
17. Quando a digitalização estiver concluída, salve a imagem. Recomenda-se escolher uma convenção de nomenclatura padrão para imagens para facilitar a referência. A imagem agora pode ser carregada no programa de análise de dados de preferência para normalização de dados e cálculo de valores de intensidade.

Resultados representativos

Você pode primeiro começar a avaliar a eficiência da reação de marcação de fluorescência Cy3 do cDNA ao iniciar as lavagens com 0,1X SSC. Durante cada lavagem subsequente, o fluxo deve se tornar menos rosado com o último fluxo claro. Além disso, o produto de cDNA marcado com Cy3 deve estar visível na coluna durante essas etapas de lavagem. Se o fluxo for de cor rosa brilhante ou não houver produto rosa na coluna, isso é uma boa indicação de que a reação de rotulagem não ocorreu corretamente. A reação de marcação pode ser avaliada quantitativamente usando o espectrofotômetro NanoDrop ND-1000 para determinar a concentração do DNA marcado e a proporção base/corante (Figura 1). A reação de marcação rotineiramente produz pelo menos 10 μg de DNA marcado em nosso laboratório. A incorporação do corante pode ser calculada usando uma proporção simples de base/corante, onde a proporção de nucleotídeo para Cy3 é igual à proporção A₂₆₀/A₅₅₀ multiplicada por 23,15. Valores variando de 50-80 indicam incorporação suficiente de corante na reação de marcação. Se a reação de marcação produzir uma baixa concentração de DNA ou má incorporação de corante, a hibridização da amostra no microarray não é recomendada e a reação de marcação deve ser repetida.

A avaliação da qualidade da hibridização pode ser realizada avaliando o histograma da imagem e a imagem digitalizada do microarray (Figura 2). As hibridações aceitáveis terão 1-2% das características saturadas (ou seja, produzindo contagens normalizadas de 1e-5 no limite de saturação de 65.000) com o valor PMT definido próximo a 500. Se o valor de PMT tiver que ser ajustado drasticamente de 500 para atingir contagens normalizadas de 1e-5 no limite de saturação de 65.000, isso geralmente indica hibridização pobre do cDNA marcado com o microarray. A qualidade dos dados será compreendida se esses dados forem continuados por meio de análises subsequentes. A qualidade da hibridização também pode ser avaliada qualitativamente visualizando imagens da matriz digitalizada (Figura 3). O kit de hibridização NimbleGen da Roche contém uma mistura oligo de alinhamento de oligonucleotídeos de 48mer marcados com Cy3 e Cy5 que hibridizam com recursos de alinhamento nas matrizes. A avaliação qualitativa da intensidade dos oligos de alinhamento com outras características na matriz permite uma verificação de qualidade da eficiência de hibridização do cDNA marcado com fluorescência na matriz. Após uma análise mais aprofundada, um gráfico de dispersão dos dados analisados pode ser usado para determinar os níveis relativos de expressão gênica e identificar genes que são expressos diferencialmente entre suas amostras (Figura 4).

Figura 1. Um espectro NanoDrop de cDNA marcado com Cy3. O rendimento do cDNA marcado e a incorporação do corante podem ser avaliados usando um espectrofotômetro NanoDrop ND-1000. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior da figura 1.

Figura 2. Um histograma GenePix para varredura de microarray. A qualidade da hibridização pode ser avaliada avaliando o histograma da imagem. As hibridizações aceitáveis terão 1-2% dos recursos saturados com contagens normalizadas 1e-5 no limite de saturação de 65.000 com o valor PMT definido próximo a 500. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada da figura 2.

Figura 3. Uma imagem de microarray digitalizada. A qualidade da hibridização pode ser avaliada visualizando a imagem digitalizada do microarray. A imagem deve ser examinada quanto à presença de poeira ou outros fatores interferentes que proíbam a visualização de cada característica e, assim, impeçam o cálculo preciso da intensidade de fluorescência da característica. A intensidade dos oligos de alinhamento pode ser comparada com os outros recursos da matriz para avaliar a eficiência da hibridização.

Figura 4. Um gráfico de dispersão de um experimento de microarray analisado. O objetivo deste procedimento é identificar genes que são diferencialmente expressos em suas amostras. Os dados de microarray podem ser analisados e visualizados em um gráfico de dispersão para visualizar genes que são expressos diferencialmente.

Tabela 1. Componentes do kit de hibridização Roche NimbleGen para adicionar à etapa 2 de hibridização.

componente volume Amostra (dissolvida em água) 5 μl Buffer de hibridização 2X 9 μl Hyb A 3,6 μl Alinhamento Oligo 0,4 μl Volume total 18 μl

Tabela 2. Limpe os buffers a serem preparados para a lavagem de matrizes após a hibridização.

componente Tampão de lavagem IA* Tampão de lavagem IB Tampão de lavagem II Tampão de lavagem III Água 225 ml 225 ml 225 ml 225 ml 10X Tampão de Lavagem I, II ou III 25 ml 25 ml 25 ml 25 ml 1 M TDT 25 μl 25 μl 25 μl 25 μl Volume total 250 ml 250 ml 250 ml 250 ml

*Pré-aquecer a 42°C

Discussion

Protocolos microarray muitos, incluindo o detalhado aqui, use corantes fluorescentes como meio de medir e quantificar a hibridização. O corante fluorescente Cy3 é sensível a foto e degradação de ozônio. Recomenda-se que o procedimento seja realizado em uma iluminação mínima. Além disso, pequenas partículas de poeira pode interferir com a hibridação e digitalização. Especial atenção deve ser dada para garantir que a área de trabalho está limpo e livre de poeira.

Há muitas alternativas para o ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Secador de Microcentrífuga de Matriz	ISC Bioexpress	C-1303-T
Sistema de Marcação Genômica BioPrime Array CGH	Invitrogen	18095-011
Cianina 3-dCTP	PerkinElmer, Inc.	NEL576
GenePix 4000B	Dispositivos Moleculares	GENEPIX 4000B
Microcon YM-30	EMD Millipore	42411
Acessórios de Processamento de Matriz NimbleGen	Grupo Roche	5223539001
Kit de Hibridização NimbleGen	Grupo Roche	5223474001
Sistema de Hibridização NimbleGen 4	Grupo	Roche
5223652001 Kit de Buffer de Lavagem NimbleGen	Roche Group	5223504001
X1 Mixers	Roche Group	5223725001