Preparação e Cultura de explantes Rat Lens epitelial para estudar a diferenciação terminal

Resumo

Explantes da região central da lente de ratos epitélio diferenciar de forma síncrona quando cultivadas na presença de FGF-2. Microscopia de imunofluorescência de tais culturas pode fornece informações romance sobre a expressão gênica e eventos de sinalização associado com a diferenciação terminal.

Resumo

A superfície anterior da lente ocular é coberto por uma monocamada de células epiteliais, que proliferam em uma zona anular subjacente ao corpo ciliar. Após a divisão, essas células migram posteriormente, onde FGF difusão da retina os induz a se diferenciar em uma vasta posterior de células lente alongado fibra, que compõem o grosso da lente. Diferenciação das células epiteliais em fibras lente lente pode ser induzida in vitro pelo cultivo de explantes da região central do epitélio anterior, na presença de FGF-2. Explantes são preparados a partir de lentes de ratos recém-nascidos através da remoção da lente do olho e agarrar a cápsula da lente no lado posterior com uma pinça de dissecação. A cápsula posterior é então delicadamente rasgada e pressionado para o fundo de plástico de um prato de cultura de tecidos. As regiões periféricas do explante são removidos com um bisturi ea área central é, então, cultivadas na presença de 100ng/ml FGF-2, enquanto 2-3 semanas, dependendo dos parâmetros a serem estudados. Como as células epiteliais em explantes cultivados diferenciar em sincronia aproximada por um período de dias ou semanas, o tempo de sinalização e expressão gênica pode ser determinada usando técnicas moleculares, bioquímicos e farmacológicos. Microscopia de imunofluorescência é um complemento poderoso para estes métodos, uma vez que demonstra a localização subcelular de proteínas de interesse e pode revelar as conseqüências fisiológicas de manipulações experimentais de vias de sinalização.

Protocolo

Parte 1: Remoção de lentes

Materiais e reagentes:

1. Micro-tesouras de dissecação, curvado, dicas blunt, (tais as.RS-5983, Roboz Surgical Instrument Co., Inc, Gaithersburg, MD); micro-pinças de dissecação ponta, curvadas (como Roboz # RS5137).
2. Meio de suspensão: Meio 199 contendo 0,1% de albumina bovina sérica, 100 unidades / ml de penicilina, estreptomicina 100μg/ml, 2,5 mg / ml anfotericina B. Os reagentes estão disponíveis a partir Invitrogen, Carlsbad, CA.

Procedimento:

1. Euthanize ratos recém-nascidos (com idade entre 2-4 dias), em conformidade com as orientações fornecidas pelo National Institutes of Health, Bethesda, MD.
2. Remove as pálpebras com uma tesoura cirúrgica. Pressione delicadamente com uma pinça curva em lados opostos da órbita ocular para forçar o olho a protuberância para fora. Fazer uma pequena incisão no lado posterior do olho com a tesoura. Pressionando com uma pinça contra a lateral do olho oposto a incisão, a lente e uma pequena quantidade de humor vítreo ligado pode então ser forçado para fora através da ruptura, permitindo que a lente a ser pego com uma pinça curva. Cuidados devem ser tomados para não quebrar a cápsula do cristalino.
3. Use a pinça curvas para as lentes de transferência para uma placa de cultura de tecido de plástico contendo 60 milímetros 5ml quente, meio de suspensão estéril.

Parte 2: Microdissecção de explantes

Materiais e reagentes:

1. Micro Pinças de dissecação, 0,1 dicas mm, (como Roboz RS-4976). Usamos liga Dumostar devido à flexibilidade da ponta, mas outras ligas de aço também são aceitáveis. Pinça com pontas mais finas do que 0,1 milímetros não são recomendados, pois eles tendem a quebrar ou dobrar durante este procedimento.
2. Meio de suspensão (ver parte 1)
3. Não suplementado meio Ham F12 ou Médio 199 (Invitrogen, Carlsburg, CA)

Procedimento:

1. Os seguintes passos devem ser realizados em um ambiente limpo, sem correntes de ar ambiente, utilizando ferramentas de dissecação e estéril meio estéril.
2. Usando um microscópio estéreo de dissecação, limpar as lentes de qualquer tecido conjuntivo aderente com a pinça de ponta 0,1 mm e transferi-los para um prato de cultura contendo 60 milímetros segundo meio de suspensão 5ml estéril (esta etapa ajuda a reduzir a contaminação). Com a pinça, transfira o número desejado de lentes para um prato de cultura contendo 35 milímetros 5ml médio, estéril não suplementado. (Muitas vezes usamos F12 Ham (Invitrogen) para esta etapa, pois a menor concentração de corante torna a dissecção mais fácil, no entanto, Meio 199 também é aceitável Sem antibióticos ou outras adições são necessários durante esta etapa..) Como muitos como 12 explantes podem ser feitas no centro de um prato desse tamanho. No entanto, um prato de 35 mm deve ser usado mesmo se explantes menos devem ser feitas, porque as ferramentas de dissecação não pode ser manipulado facilmente em um pequeno prato. Colocar a cápsula contendo as lentes restantes para uma cultura de tecidos incubadora a 37 ° C até serem necessárias.
3. Identificar a face posterior da lente. Há muitas maneiras de reconhecer isso: 1) O posterior é mais arredondada do que a anterior, que é um pouco achatado, 2) de ratos recém-nascidos lentes de catarata forma fria como eles arrefecer à temperatura ambiente durante a dissecção. Se a catarata frio não foi completamente cheio a lente, o lado posterior é o lado mais distante da região opaca. Se a opacidade encheu a lente, o aquecimento do prato para 37 ° C por alguns minutos vai revertê-lo. O lado posterior podem ser identificadas como as reformas de catarata com o resfriamento. 3) Vestígios da túnica vasculosa lentis pode ser visível no lado posterior. 4) A sutura posterior pode ser visível no lado posterior. Identificar o lado posterior corretamente é essencial, uma vez que este é o local onde a cápsula será aberta. Abertura da lente na face anterior vai rasgar o epitélio.
4. Uma vez que o lado posterior foi identificado, transformá-lo para cima e agarrar as lentes da pinça esquerda (para um trabalhador com a mão direita). Em seguida, aperte a cápsula posterior com a pinça direito de produzir uma pequena dobra.
5. Enquanto segura a cápsula posterior com a pinça direita, segure a dobra da cápsula com a pinça esquerda e puxe os dois pares de pinças em direções opostas para fazer um pequeno rasgo na cápsula.
6. Ao segurar a borda da cápsula retraindo com a pinça, puxe-o para baixo, primeiro de um lado, depois do outro, pressionando-o no plástico do prato com a pinça. Repita isso várias vezes, movendo-se em todo o equador da lente, até que a cápsula está firmemente ligado à placa em muitos pontos. Segurando a cápsula no lugar com a pinça esquerda, agite levemente a massa de fibra com a pinça direito de quebrar o vínculo entre as células de fibras e células epiteliais no equador do cristalino. Em seguida, empurre a massa de fibra de distância, rolando-o fora da cápsula / epitélio, que permanece preso à parte inferior doprato. Continue esse processo com todas as lentes no prato. Retire e deite fora as massas de fibras (ou salvá-los congelados como fonte de proteínas das lentes para outros estudos).

Parte 3: Microdissecção e cultura de explantes centrais

Materiais e reagentes:

1. Estéril bisturi descartável, lâmina # 15, (Cincinnati Surgical Co. Cincinnati, OH)
2. Fosfato estéril salina tamponada com cálcio e magnésio (Invitrogen, Carlsbad, CA)
3. Meio de cultura: meio de suspensão contendo 100ng/ml FGF-2 (Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO).

Procedimento:

1. Utilizando um escalpelo esterilizado, apare o epitélio periférico (PE), que contém células em estágios iniciais de diferenciação (Figura 1A), deixando uma praça central de aproximadamente 2,0 milímetros de um lado, composta por células epiteliais centrais apenas (CE) (Figura 1B).
2. Transferência do prato contendo os explantes central para uma cabine de segurança biológica. Lavar 3 vezes com PBS estéril, contendo cálcio e magnésio, e uma vez com 1ml de meio de suspensão fresco, equilibrado (37 CO ° C, 5% _2). Essas lavagens reduzir muito a probabilidade de contaminação.
3. Adicionar 2 ml de meio de cultura para induzir a diferenciação de ^uma, e coloque os explantes em umidificado, cultura de tecidos incubadora a 37 ° C CO, 5% _2. Períodos de cultura pode ser tão curto quanto algumas horas ou prolongar o tempo que duas a três semanas, dependendo do parâmetro que está sendo estudado. Médio deve ser trocada a cada 2-3 dias.

Parte 4: A colheita de explantes para a análise de eventos associados com a diferenciação

1. Explantes colheita para análise de proteína ou RNA

Materiais:

1. Pinças Microdissecting
2. SDS Lysis Buffer de RNA ou mais tarde

Procedimento:

1. No final do período de incubação, remova o meio de cultura.
2. Usando o microscópio estéreo de dissecação, com cuidado, solte as bordas de cada explante.
3. Levantar cada explante com a pinça e transferir para um tubo contendo cerca de 100μl tampão de lise SDS (para análise de proteínas) ou RNA-posterior (para análise de RNA). Agitar a ponta da pinça na solução para garantir que o explante não ficar com a pinça.

2. Explantes de colheita, para imunofluorescência

Materiais e reagentes:

1. Tampão fosfato salino com cálcio e magnésio (Invitrogen, Carlsbad, CA)
2. Tampão fosfato (sem cálcio e magnésio) (Invitrogen, Carlsbad, CA)
3. Paraformaldeído 4% (Bioproducts Boston, Worcester, MA)
4. Pinças Microdissecting
5. Pena de marcação hidrofóbica
6. Microscópio de lâminas de vidro
7. 0,25% Triton X-100 em tampão fosfato salino.

Procedimento:

1. Enxaguar explantes brevemente em PBS contendo cálcio e magnésio.
2. Fixar tecidos, adicionando paraformaldeído a 4% por 30 minutos em temperatura ambiente.
3. Remova o fixador e substituir com tampão fosfato salina. Explantes fixa-se um pouco rígida, permitindo-lhes ser levantado e transferido para lâminas de vidro para a imunocoloração.
4. Coloque uma pequena gota de PBS (sem cálcio e magnésio) no slide para ajudar a posicionar o tecido e evitar curling. Usando uma pinça microdissecting, levante o explante e insira-o a queda no slide. Sem tocar o explante, cuidadosamente remover o líquido com um pavio de papel para achatar o explante no vidro e deixar o tecido secar ao ar em temperatura ambiente por 3-5 minutos.

Figura 1 A. O epitélio periféricos expressa diferenciação proteínas específicas. O explante foi mostrado histoquímica para N-caderina imediatamente após microdissecção. Expressão é visto em uma faixa de células do epitélio periféricas, indicando que as células nesta região começaram a se diferenciar. B. O epitélio periférico pode ser aparado para remover as células que expressam N-caderina e outros diferenciação proteínas específicas. O anel vermelho representa a localização das células que expressam N-caderina, enquanto o pequeno quadrado delineado em cinza representa o quadrante do epitélio mostrado no painel de 1A. O epitélio periféricos podem ser removidos por quatro cortes de bisturi, deixando um quadrado central que contém apenas as células que ainda não começaram a se diferenciar.

Discussão

O rato sistema explante lente tem sido utilizado com sucesso por um número de laboratórios para estudar a diferenciação terminal das células epiteliais lente para lente de fibras ^21,3,4,5. Quando exposto a FGF-2 em 100ng/ml explantes começará a mostrar mudanças na sinalização em poucos minutos ^6, com as mudanças na morfologia e expressão de genes que aparecem sequencialmente durante vários dias ^3,4,5. As culturas permanecem viáveis ​​por 2-3 semanas, se o cuidado é tomado para evitar contaminação.

Os explantes centrais descritas neste protocolo são especialmente úteis para estudar a seqüência de eventos associados com a diferenciação, uma vez que contêm poucas ou nenhumas células que expressam marcadores de diferenciação antes de FGF-2 é adicionado ^1,5. As células então diferenciar de forma síncrona, como um grupo, tornando possível acompanhar a evolução no tempo da sinalização e eventos transcricionais associadas com a diferenciação. Explantes de cultura para diferentes comprimentos de tempo, portanto, fornece informações precisas sobre os temporais eventos seqüência. Inibidores específicos podem ser adicionados ao meio de cultura para identificar relevantes vias de sinalização. Explantes podem ser usados ​​para analisar a expressão de proteínas por eletroforese em gel de SDS e immunoblotting ou para analisar a expressão de mRNAs específicos por RT-PCR. Faixa de rendimento de proteína 20-50 mcg / explante e rendimento de RNA é de cerca de 200-600 ng / explante, dependendo da duração do período de cultura. Nós geralmente descobrimos que explantes por 5-6 prato irá fornecer proteínas suficientes ou RNA para ensaios diversos. RNA a partir de explantes também pode ser usado para preparar cDNA para avaliar a expressão gênica por microarranjos de análise, que pode identificar novos genes que podem ser fundamentais para diferenciação. Explantes também podem ser transfectadas. Apesar de a eficiência de transfecção é geralmente baixa, é suficiente para assaying genes repórter ^{4, 7, 8.} Microscopia de imunofluorescência dos explantes oferece um complemento útil para métodos bioquímicos determinando a localização subcelular de proteínas de interesse. Assim, a preparação ea cultura de explantes de lente rato fornece um sistema poderoso para estudar a diferenciação terminal lente em mamíferos, que podem complementar em técnicas in vivo, tais como a geração de camundongos transgênicos e knock-out.