A capacidade de células germinais embrionárias de se diferenciarem em células germinativas primordiais durante estágios iniciais de desenvolvimento é um modelo perfeito para abordar nossa hipótese sobre o câncer e infertilidade. Este protocolo mostra como isolar células germinativas primordiais das gônadas em desenvolvimento 10,5-11,5 dias após a embriões de camundongos coitum.
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Artigo de método
Isolamento e derivação de células embrionárias de rato Germinal
Neste artigo
Resumo
Resumo
A capacidade de células germinais embrionárias (EG) de se diferenciar em células germinativas primordiais (PGCs) e mais tarde em gametas durante as primeiras fases de desenvolvimento é um modelo perfeito para resolver a nossa hipótese sobre o câncer e infertilidade. Este protocolo mostra como isolar células germinativas primordiais das gônadas em desenvolvimento 10,5-11,5 dias pós coitum embriões (DPC) do mouse. Desenvolvimento gonadal cumes de embriões de camundongos (C57BL6J) foram dissociadas pela ruptura mecânica com colagenase, então banhado em um rato camada de alimentador de embrião de fibroblastos (MEF-CF1) que foi previamente mitoticamente inativada com mitomicina C na presença de mídia nocaute e suplementada com inibidor de leucemia fator (LIF), fator de crescimento básico de fibroblastos (bFGF) e fator de Stem Cell (SCF). Usando esses métodos otimizados para a identificação PCG, isolamento e estabelecimento de condições de cultura permite culturas de longo prazo de células EG por mais de 40 dias. O embrionárias linhagens de células germinais embrionárias mostrou fenótipo e expressão de marcadores utilizados comum do estado pluripotente. Isolamento e derivação de células germinais na cultura fornecer uma ferramenta para entender o seu desenvolvimento in vitro e oferecer a oportunidade de acompanhar os danos cumulativos ao nível genético e epigenético após a exposição ao estresse oxidativo.
Protocolo
Parte 1: Laparotomia rato grávidas
- Usando deslocamento cervical, euthanize um rato C57BL6J fêmea grávida em 10,5-11,5 dpc.
- Limpe o abdômen com sabão antimicrobiano, e em seguida, fazer a barba dele.
- Após o barbear, lavar o abdômen com uma solução salina.
- Depois, seque o abdômen com uma gaze estéril.
- Cobrir o mouse com um novo campo estéril.
- Faça uma incisão ventral usando uma pinça e tesouras de dissecação.
- Identificar e remover todo o útero da cavidade abdominal. Embriões de camundongos será visível dentro do útero.
- Transferência do útero em uma placa de Petri cheia de D-PBS, e mantê-lo....
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Divulgações
Esta pesquisa foi realizada após revisão e Animal Care Use Institucional e Comitê de aprovação (IACUC) do nosso protocolo de mouse # 08030 (O Papel das espécies reativas de oxigênio-ROS no germe de desenvolvimento de linha e formação de tumores: Holding e criação de protocolo) no Mississippi State University.
Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer a ajuda inestimável de: Dr. Neal First e Kourtney Wilkinson para manuscrito edição; Dr Lucy Senter, Dr. Brigit Willeford e Mike Basett de assistência com a formação e animal cuidados na instalação do mouse MSU ALAC credenciados; Dr. Dwayne Sábio por sua assistência com microscopia e captura de imagem; Cesar Monroy, Hannah Swoope, e Bobbie Huddleston por sua assistência com a produção de vídeo na MSU. Esta pesquisa foi financiada pelo Instituto de Pesquisa Institucional e do Departamento de Ciências Biológicas da Mississippi State University.
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Materiais
Pinça N º 14 e 15, 35 mm bisturi, tesouras de dissecação, campos cirúrgicos, sabão antimicrobiano, solução salina 0,9%, gaze, recipiente de espuma de gelo, lâmina de barbear, bisturi de 35 mm, pinças de multa n º 4 e 5, provocando agulha fina com manusear, filtro de folhas de papel, e puxou pipetas de vidro.
Equipamento: estereomicroscópio dissecação, fonte de luz Schott Fostec, microscópio invertido, micropipeta 10 e 200ul, centrífuga, bio Gabinete de segurança.
Equipamento: estereomicroscópio dissecação, fonte de luz Schott Fostec, microscópio invertido, micropipeta 10 e 200ul, centrífuga, bio Gabinete de segurança.
Referências
- DeFelici, M. Cell Biology: A laboratory Handbook. 1, Second Edition, 73-85 (1998).
- Donovan, P. J., De Miguel, M. P. Turning Germ Cells into Stem Cells. Current Opinion in Genetics and Development. 13, 463-471 (2003).
- Labosky, P. A., Hogan, B. L. M. Part 12: Mouse Primordial Germ Cells: ....
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Reimpressões e permissões
