Aqui nós mostramos como fazer retro-orbital injeção em peixe-zebra adulto.
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Artigo de método
Retro-orbital de injeção no Zebrafish Adulto
Neste artigo
Resumo
Resumo
Tratamento medicamentoso de animais inteiros é uma ferramenta essencial em qualquer sistema modelo para farmacológicos e químicos estudos genéticos. Injecção intravenosa (IV) é muitas vezes a forma mais eficaz e não invasivo de transporte de um agente de interesse. No peixe-zebra (
Protocolo
Parte 1. Preparação de material de injecção
- Tg (globina: GFP) células:
- Sangrar peixes doadores adultos usando ponteira 10ul revestido em heparina (1unit/ul) para pescar punção por trás de emalhar.
- Aspirar glóbulos vermelhos e dispensar em tampão celular (0.9x PBS + 5% de SFB + 1% Pen / Strep).
- Suspensão de células filtro sobre malha 40uM e determinar a concentração de células usando hemocitômetro como descrito por LeBlanc et al.
- Spin down e ressuspender em tampão celular na concentração desejada de tal forma que o volume de injeção final não é mais do que 5ul. Aqui nós injetar 1,5-2000000 células / destinatário.
- Para o, dextran Texas Red ®, dissolver o corante em DPBS para uma concentração final de injecção de 10-12 mg / mL. Plano para injetar 4 uL por peixe.
Parte 2. Injeção
- Anestesiar peixes em tricaina (4.2ml (4mg/ml) peixes de água tricaine/100ml).
- Lavar seringa Hamilton 3-4 vezes antes da injeção utilizando etanol 70%. Enxágüe 3-4 vezes com DPBS 0.9x.
- Coloque os peixes lado dorsal para cima e virado para a direita na esponja úmida.
- Segure a seringa Hamilton com a mão direita e com o dedo indicador sobre o êmbolo. Suavemente estabilizar o corpo do peixe com a mão esquerda.
- Posição da agulha com o bisel voltado para cima de tal forma que se o olho do peixe s fosse um relógio, a agulha seria apontar para a posição 7:00 e em um ângulo de 45 graus para o peixe (figura 1).
- Inserir a agulha delicadamente 1-2 mm em posição 7:00 e lentamente o êmbolo.
- Permitir que os peixes na água para recuperar E3 fresco.
- Lavar agulha, como descrito acima, entre as injeções de reagentes diferentes.
- Solução Flick célula para ressuspender as células a cada poucos minutos para evitar aglomeração de células.
- Manter o fluxo de peixe por 1 semana com mudanças de água diariamente para evitar a infecção. Mantemos peixe na água UTI para esse período (10 ml + casaco Estresse pemafix 5mL + melafix 5mL por 38 litros de água E3).
Parte 3. Resultados representante
Quando realizada corretamente, é possível visualizar material injetado, se tiver sido rotulado de alguma forma. Por exemplo, Tg (globina: GFP), as células vermelhas do sangue deve ser visto sob um microscópio fluorescente dissecção circulando na vasculatura do destinatário peixes casper logo após a injeção, como mostrado na figura 2. Da mesma forma, a injeção de um dextran 70kDa, conjugado com Texas Red ® pode ser visualizado na vasculatura de peixe transparente imediatamente após a injeção de retro-orbital (figura 3). Células de rim fluorescente de Tg (β-actina: GFP) de peixes doadores também podem ser injetados retro-orbital em peixes irradiados casper destinatário. Estas células acabará casa até a medula destinatário (figura 4a) e pode então ir para repovoar o rim depois de várias semanas (figura 4b).
Se a injecção é muito raso ou o ângulo da agulha ignora a retro-orbital cavidade do seio venoso, material injetado pode ser visualizado pooling em torno do olho ou saindo dela. Alternativamente, se a injeção é muito profundas, os peixes podem sofrer danos tecido ou sangramento excessivo, mas eles ainda podem se recuperar. Quando realizada corretamente, a mortalidade após retro-orbital injecção deve ser inferior a 5% do peixe total injetado e sucesso de entrega para a corrente sanguínea deve ser superior a 90% do peixe total injetado.
Figura 1: Ilustração de retro-orbital técnica de injeção. O olho direito do peixe é representado como um relógio analógico em que os sete posição do relógio o corresponde ao local de injeção correta.
Figura 2: Tg (globina: GFP) glóbulos vermelhos circulantes na vasculatura da cauda de um peixe adulto casper três dias depois de retro-orbital injeção.
Figura 3: A injeção de sucesso de um dextran 70kDa conjugado com Texas Red ® usado como corante fluorescente produz vasculatura no peixe adulto transparente, casper e é facilmente visualizado utilizando microscopia de fluorescência padrão todo animal.
Figura 4a: Três dias após retro-orbital injeção de células de rim de todo medula Tg (β-actina: GFP) de peixes doadores, as células podem ser visualizados homing para a medula renal de peixes irradiados receptor adulto casper.
Figura4b: Quatro semanas após a retro-orbital injeção de células de rim de toda a medula da Tg (β-actina: GFP) de peixes doadores, o repovoamento do rim destinatário com células da medula do doador verde toda rim pode ser visualizado na irradiados peixes receptor adulto casper.
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Discussão
Retro-orbital injeção em peixe-zebra adulto dá a maior eficiência de entrega de material injetado na corrente sanguínea com a menor incidência de mortalidade. Devido à natureza do local de injeção, a punção parece curar rapidamente, diminuindo a ocorrência de infecção e da quantidade de perda de sangue. O site pode até ser injetado repetidamente durante um curto período de tempo para injeções diárias de medicamentos, por exemplo.
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Agradecimentos
Este trabalho é apoiado por Howard Hughes Medical Institute e uma concessão do NIH para o estudo da hematopoiese embrionária.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Sal de heparina sódica da mucosa intestinal de suíno | Sigma-Aldrich | 2106 | Frasco pré-pesado de 300 unidades USP |
| Tricaine-S | Western Chemical | MS-222 | |
| Dulbecco’s Solução Salina Tamponada com Fosfato | Invitrogen | 14190-144 | |
| Dextran, Texas Red® | Molecular Probes, Life Technologies | D1830 | |
| E3 | 5 mM NaCl 0,17 mM KCl 0,33 mM CaCl2 0,33 mM MgSO₄2 | ||
| Seringa de microlitros | Hamilton Co | 80300 | 701N 10 µL SYR (26s/2”/2) |
Referências
- Steel, C. D., Stephens, A. L., Hahto, S. M., Singletary, S. J., Ciavarra, R. P. Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus as route of intravenous drug delivery in a transgenic mouse model. Lab Animal. 37, 26-32 (2008).
- Pinkerton, W., Webber, M. A method of injecting small laboratory animals by the ophthalmic plexus route. Proc. Soc. Exp. Bio. Med. 116, 959-961 (1964).
- White, R. M., Sessa, A. S., Burke, C., Bowman, T., LeBlanc, J., Ceol, C., Bourque, C., Dovey, M., Goessling, W., Burns, C. E., Zon, L. I. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).
- LeBlanc, J., Bowman, T. V., Zon, L. I. Transplantation of whole kidney marrow in adult zebrafish. J. Vis. Exp. , (2007).
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Reimpressões e permissões
