Modelagem Colite murino utilizando Dextran Sulfato de Sódio (DSS)

Resumo

Dextran sulfato de sódio (DSS), administrada na água de beber é um modelo de lesão inflamatória estabelecida murino de colite aguda. Este protocolo descreve o método para o tratamento DSS ea preparação dos tecidos.

Resumo

Colite pode ocorrer por infecções virais ou bacterianas, insulto isquêmico, ou doenças auto-imunes; Colite Ulcerativa e mais notadamente a variante do cólon da doença de Crohn - Colite de Crohn. Colite aguda podem apresentar dor abdominal e distensão, má absorção, diarréia, hematoquezia e muco nas fezes. Estamos começando a entender as complexas interações entre o meio ambiente, genética e disfunção da barreira epitelial em modelos de doença inflamatória intestinal e animal de colite têm sido essenciais para fazer avançar a nossa compreensão da doença. Um modelo popular envolve completando a água potável de camundongos com sulfato de baixo peso molecular de sódio Dextran (DSS), resultando em danos epiteliais e uma resposta robusta inflamatória no cólon de vários dias

Protocolo

Parte 1: Lesão Modelo de Colite

1. Peso inicial deve ser obtido para cada rato antes do início do tratamento DSS.
2. Fazer uma de 3% (w / v) Sulfato de Dextran solução de sal de sódio em água e filtrar com um filtro de 0,45 mM de acetato de celulose.
3. Substituir a água potável na gaiola do rato com a solução DSS 3% por quatro dias. Os ratos não devem ter acesso a qualquer outra fonte de água (ou seja, a exclusão dicas colocados em sistemas de rega automática).
4. No dia quatro, substitua a solução DSS com água por mais três dias, permitindo alguma recuperação do cólon epiteliais. Os ratos devem ser pesados ​​no dia quatro, a fim de quantificar conseqüências sistêmicas da colite. Perda de peso é comum com ferimentos graves.
5. No dia 7, pesar e sacrifício dos ratos. Ratos podem ser sacrificados por overdose inalatória de isoflurano, ou outros institucionalmente, IACUC métodos aprovados.

Parte 2: Necropsia e Colheita de Colon

1. Expor o lado ventral do rato e pernas seguro para garantir o acesso livre para o abdômen. Molhar o abdômen completamente com álcool 70%.
2. Segure a linha média do abdómen com uma pinça e estender para cima, assim tenting a pele. Use uma tesoura de ponta fina para o abdômen inciso expondo o conteúdo abdominal. Estender a incisão para a ponta do apêndice xifóide na linha média e depois estender ao longo do aspecto inferior das margens costal, bilateralmente.
3. Identificar o intestino delgado, ceco e cólon. Dissecar cuidadosamente / provocação do cólon a partir do mesentério circundante. Transecto do cólon profundamente na pelve, para libertar o cólon distal e reto. Transecto os dois pontos na margem colonocecal para libertar o cólon proximal. Cuidados devem ser tomados durante este processo para não danificar o colon como a limpeza do cólon será problemático se ocorrer perfuração.
4. Utilizando uma agulha 20G alimentação e seringa de 10 ml, entubar e lave o cólon com gelado PBS até que o eluido está completamente limpa de fezes.
5. Neste ponto, se a análise macroscópica com um microscópio de dissecação é desejado, os dois pontos podem ser fixados como "lingüiça". Se a análise histológica é apenas desejável do que prosseguir para a Parte 4 "Fazendo Rolls Suíça para a análise histológica de colite aguda".

Parte 3: Processamento como "Lingüiça" para análise macroscópica de todo o cólon

1. É importante manter a correta orientação do cólon, portanto, manter a extremidade distal do cólon mais próximo do operador. Corte dois pedaços de sutura não absorvível (SP116 1,5 seda trançada métricas), uma polegada de aproximadamente 1 em comprimento, os outros 2 polegadas.
2. Use a peça 2 polegada de sutura para amarrar a extremidade distal mais próximo à margem quanto possível, mantendo uma boa vedação.
3. Coloque uma agulha 20G alimentação contendo 5 ml de tampão fosfato 10% de formol na extremidade proximal do cólon. Vagamente empate a parte restante da sutura imediatamente proximal ao bulbo da agulha de alimentação. Segure firmemente os dois pontos no bulbo da agulha de alimentação e infundir formalina até o cólon é expandido. Apertar o nó na sutura que você retire a agulha de alimentação, deixando a infusão de cólon, expandiu como um "salsicha".
4. Encha um tubo de 15 ml com 10% de fosfato tamponada de formalina e coloque os dois pontos no tubo. Correção para 24 horas.
5. Deitar fora formalina e substituir com EtOH 70% para um 24 horas adicionais. (Colons podem ser armazenados em EtOH 70% indefinidamente à temperatura ambiente.)
6. Remova os dois pontos do tubo cônico e cortou as cordas em cada extremidade com um bisturi, tomando cuidado para não danificar o colon. Lembre-se que a extremidade distal tem o maior pedaço de corda. Corte longitudinal do distal para extremidade proximal do cólon para que forme uma longa folha. Neste ponto, o cólon pode ser visto sob um microscópio de dissecação.

Parte 4: Making Rolls Suíça para a análise histológica de colite aguda

1. É importante manter a correta orientação do cólon, portanto, manter a extremidade distal do cólon mais próximo do operador.
2. Meça o comprimento do cólon. Esta métrica é um indicador da gravidade da lesão. Colite aumenta edema e encurta o comprimento do cólon em geral.
3. Usando uma tesoura de ponta fina, inciso longitudinalmente de distal para proximal final do cólon. Use uma pinça bem cotado para agarrar a borda da incisão e aberto lateralmente trabalhando o seu caminho distalmente-> proximalmente, assim, mostrando o cólon como uma folha plana.
4. Rolando o cólon exige um par de fórceps e uma técnica de duas mãos. Segure a borda da margem distal com uma pinça. Proceder à seqüencialmente rolo do cólon através da rotação e liberando a pinça de prosseguir para a margem proximal. Gerando assim uma espiral com uma terceira dimensão ou "Swiss roll".Para manter a forma rolada, segure o rolo com firmeza com uma pinça e transectos com uma agulha 27G1 / 2. Segura a agulha, dobrando a agulha que sai do rolo.
5. Coloque o rolo em uma fita de tecido devidamente rotulados e coloque em um frasco de 10% de fosfato tamponada de formol em temperatura ambiente por 24 horas para garantir a fixação do tecido.
6. Deitar fora formalina e substituir com EtOH 70% para um 24 horas adicionais. (Colons podem ser armazenados em EtOH 70% indefinidamente à temperatura ambiente.)
7. Uma vez que a amostra foi corrigido, ele pode ser incluído em parafina, seccionado e montado em lâminas para análise histológica.

Parte 5: Resultados Representante

O modelo DSS para a colite aguda permite ao pesquisador obter, corrigir e analisar dois pontos que a colite aguda modelos. Quando o rolo suíço é cortado e montado, ele deve formar uma fatia representativa de todo o cólon, se rolou corretamente (Figura 1). O rolo montado podem ser marcadas com H & E, a fim de determinar a extensão dos danos para o cólon, desde o final (para dentro) distal até o final (fora) proximal (Figura 2). Imunohistoquímica também pode ser realizada no rolo suíço para identificar e quantificar infiltrados inflamatórios. Se o método de lingüiça foi realizado corretamente, os dois pontos fixos será dilatada e toda a superfície da mucosa pode ser facilmente manipulado e visto sob o microscópio de dissecação (Figura 3).

Figura 1. Corretamente executados "Swiss roll". (A) Os dois pontos são rolados do distal para proximal final, seccionado com uma agulha e garantidos por dobrar a ponta da agulha. Em seguida, é colocada em um cassete de tecido para fixação. (B) H & E manchada seção 5 mM de um rocambole feito a partir do cólon de um rato tratados com DSS (d = cólon distal p = cólon proximal).

Figura 2. Colons DSS tratados mostrar sinais de colite aguda. Inflamação e danos cripta são aparentes no cólon DSS-tratados em comparação com um controle de água tratada.

Figura 3. Um exemplo de uma "salsicha". A salsicha infundido com formalina e completamente expandidas. Um leve ângulo estará presente secundária à curvatura natural do cólon. A salsicha aberta deve estar nivelado.

Discussão

Este protocolo pode ser modificado para modelo de lesão aguda, lesão de reparação, ou crônica processos de lesão do cólon.

Modificação lesão aguda:

DSS ad lib tratamento para 4-6 dias, seguido pelo sacrifício imediato

Lesão-Modificação:

Lesões com 4-6 dias de tratamento DSS seguido por período de recuperação de 3-4 dias e sacrifício (como descrito no protocolo acima).

Modificação colite...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Sal de sódio de sulfato de dextrano	USB Corp., Affymetrix	9011-18-1	mol wt 40,000-50,000
10% tamponado fosfato de formalina	Fisher Scientific	SF100-4
Isoflurano, USP	Phoenix Pharmaceuticals, Inc.	NDC 57319-474-06
TISSUE PATH de Macrosette	Fisher Scientific	15182706
BD Seringa de 10 ml	BD Biosciences	309604
Álcool Etílico	Pharmco-AAPER	E190	Diluir a 70% com água destilada
Agulha de alimentação reta 20G	VWR international	20068-612
27G1/2 Agulha PrecisionGlide	BD Biosciences	305109
Tesoura de Dissecação Ponta Afiada/Romba	VWR international	82027-588
Waugh Forceps	VWR international	82027-428
Sutura não absorvível	LOOK Surgical	SP116
Papel absorvente Whatman	VWR international	28298-020	Corte conforme necessário
Sem surfactante Nalgene Filtro de acetato de celulose (SFCA)	Cole-Parmer	EW-06731-2
Composto de fibra de carbono paquímetro digital	Fisher Scientific	15-007-958