Modelo murino de CD40-ativação de células B

Resumo

Neste vídeo, demonstramos o procedimento de ativação CD40-e expansão de células B murino de esplenócitos de camundongos C57BL / 6, que pode ser usado como um modelo de células apresentadoras de antígenos (APC) para estudar a indução de imunidade.

Resumo

A investigação sobre células B CD40 mostrou que melhora a sua capacidade de ativação apresentação de antígenos. Quando estimuladas com interleucina-4 e CD40 ligante (CD40L), células B humano pode ser expandido sem dificuldades a partir de pequenas quantidades de sangue periférico dentro de 14 dias para grandes quantidades de altamente pura CD40 células-B (> 10

Protocolo

O protocolo para a geração de células CD40 de murino ativado B (mCD40B) de esplenócitos é dividido em duas partes: Parte A demonstra a preparação do ligante CD40 de murino (CD40L) expressando células HeLa (tmuCD40L HeLa), que será utilizado como placa obrigado células alimentadoras. Parte B descreve a real cultura CD40-B murinos.

A. Preparação de células alimentadoras (tmuCD40L HeLa)

O HeLa tmuCD40L é uma linha de células epiteliais humanas aderente, que nunca deve tornar-se completamente confluentes. As células são, portanto, dividido por duas vezes por semana. Cultura há mais de seis semanas não é recomendado.....

Discussão

Modificações deste protocolo são possíveis, especialmente quanto à origem do estímulo-CD40 e do tipo de estirpe do rato utilizado, rendendo também na geração eficiente de células CD40 de murino B ativadas. Ahmadi et al. têm mostrado resultados semelhantes para fibroblastos de rato transfectadas com murino CD40 ligante. Nesta apresentação contexto de xeno-antígeno pode ser excluída com certeza, mas estudos intensivos em matéria de segurança e toxicidade in vivo não deu sinais de inflamação ou auto-imunidade reaç.......

Materiais

A. Preparação de Media:

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Alimentador celular médio do tipo selvagem	Alimentador meio de seleção de célula
Reagente	Concentração	Reagente	Concentração
RPMI 1640		RPMI 1640
L-Glutamina	300 mcg / mL	L-Glutamina	300 mcg / mL
FBS	10%	FBS	10%
HEPES	10 mM	HEPES	10 mM
Gentamicina	15 mcg / mL	Gentamicina	15 mcg / mL
		Higromicina B	0,2 mg / mL

mCD40-B médio de lavar	mCD40-B meio de cultura
Reagente	Concentração	Reagente	Concentração
D-MEM		D-MEM
L-Glutamina	580 mcg / mL	L-Glutamina	580 mcg / mL
Glicose	4,5 mg / mL	Glicose	4,5 mg / mL
HEPES	10 mM	HEPES	10 mM
Gentamicina	15 mcg / mL	Gentamicina	15 mcg / mL
		MEM	0,1 mM (1x)
		FBS	10%

B. Diversos Reagentes:

Reagente	Companhia	Despacho n.
RPMI 1640	Invitrogen Gibco	REF 21875
D-MEM	Invitrogen Gibco	REF 41965
Dulbeccos PBS (10x)	PAA	Cat Não H15-011
Gencin	Selecione Delta	Arte Sem 7395800
FBS	LONZA	Cat Não DE14-802C
Tampão HEPES	PAA	Cat Não S11-001
MEM NEAA	Invitrogen Gibco	REF 11140
Higromicina B	PAA	Cat Não P02-015
Recombinante murino Interleucina-4	Immunotools	Cat Não 12340045
Ciclosporina A	Novartis	Cat Não NDC 0078-0109-01
Tripsina / EDTA (10x)	Invitrogen Gibco	REF 15400-054

Fontes C. Diversos:

Reagente	Companhia	Despacho n.
Pipeta estéril dicas	Sarstedt
6-bem placa	NUNC	Não Cat 140675
50mL tubo cônico	BD Falcon ™	Não Cat 352070
Frasco de cultura de tecidos	Sarstedt	Cat Não 83.1813.002