Labeling fluorescentes de COS-7 expressando as proteínas SNAP tag-Fusion para imagens de células vivas

Resumo

SNAP-tag e CLIP tag-sistemas de rotulagem proteínas permitem o anexo, covalentes de moléculas específicas, incluindo corantes fluorescentes, a uma proteína de interesse em células vivas. Uma vez clonado e expresso, a proteína com a tag pode ser usada com uma variedade de substratos para inúmeras aplicações a jusante sem ter de clonar novamente.

Resumo

SNAP-tag e CLIP tag-sistemas de rotulagem proteínas permitem o anexo, covalentes de moléculas específicas, incluindo corantes fluorescentes, a uma proteína de interesse em células vivas. Estes sistemas oferecem uma ampla seleção de substratos fluorescentes otimizado para uma faixa de instrumentação de imagem. Uma vez clonado e expresso, a proteína com a tag pode ser usada com uma variedade de substratos para inúmeras aplicações a jusante sem ter de clonar novamente. Há duas etapas para usar este sistema: a clonagem e expressão da proteína de interesse como uma fusão SNAP-tag, e rotulagem da fusão com o substrato SNAP-tag de escolha. O SNAP-tag é uma pequena proteína humana com base em O

Protocolo

Chapeamento de células CHO-K1:

1. Adicionar 50-100μl de células CHO-K1 que foram tripsinizados de acordo com protocolos padrão de 6ml de completo F-12K.
2. Mix suspensão celular por pipetagem cima e para baixo várias vezes, então alíquota 300 ml de suspensão de células tripsinizados a cada poço de uma câmara estéril 8-Lab-Tek II Chambered lamínula com # 1.5 borosilicato lamela câmaras (Nalgene Nunc Int;. Produto # 155409; Lote: 100808-8-0).
3. Incubar as amostras a 37 ° C CO, 5% ₂ durante a noite.

Transfecção transiente de células CHO-K1 com pSNAP-ADRB2 e pSNAP-H2B:

1. Verifique as câmaras de cultura de células semeadas no dia anterior para procurar densidade celular e da saúde.
2. Rótulo o número apropriado de tubos de microcentrífuga.
3. Em uma capela de fluxo laminar, configurar misturas complexas transfecção acordo com a tabela de exemplo a seguir, usando 0,3 mg pSNAP-ADBR2 DNA Controle Plasmid ou 0,3 mg de pSNAP-H2B DNA Controle Plasmid, 1 ml de D2 TransPass e 1 ml de TransPass V por reação.

   plasmídeo	número de reações	l de soro livre de médio	mL de D2 TransPass	mL de TransPass V	mL de DNA plasmídeo	mL de D2/reaction TransPass	mL de TransPass V / reação	ng de DNA / reação	DNA conc. (Ng / mL)	mL de DNA plasmídeo / reação
   SNAP-ADRb2	5	236,5	5	5	3,5	1	1	300	472,34	0,7
   H2B SNAP-	5	237	5	5	3	1	1	300	515,89	0,6
   Simulado	5	240	5	5	0	1	1	0	0	0
   Untransfected	5	250	0	0	0	0	0	0	0	0

4. Primeiro, misture o soro livre F-12K com o DNA adequado plasmídeo, em seguida, adicione o reagente TransPass Transfection D2, em seguida, adicionar o reagente TransPass Transfection V. Misture bem os componentes pipetando cima e para baixo suavemente várias vezes após a adição de cada reagente.
5. Incubar a reação em temperatura ambiente por 30 minutos.
6. Durante a incubação, lavar as células uma vez com 600 mL de meio DMEM completo e adicionar 450 mL de meio DMEM completo para cada amostra.
7. Adicionar 50 ul da mistura de transfecção complexo para cada amostra, lentamente e de forma gota a gota.
8. Incubar as amostras durante a noite a 37 ° C, 5% CO _2.

SNAP-Cell Labeling Estrela TMR de células CHO-K1 transitoriamente transfectadas com pSNAP-ADRB2 e pSNAP-H2B:

1. Remova cuidadosamente os meios de comunicação transfecção complexas a partir de cada amostra por sucção a vácuo. Lave as células duas vezes com 600 mL de completo F-12K e substituir a mídia em cada poço com 600 mL de completo F-12K.
2. Mix de mídia rotulagem dye, adicionando 995 mL de completo F-12K e 51 mL 0,6 mM SNAP-Cell substrato TMR-Star. A concentração final da SNAP-Cell TMR-Estrela deve ser de 3mm. Pipeta cima e para baixo várias vezes para misturar após a adição de substrato.
3. Remova cuidadosamente meios de crescimento a partir de amostras e adicionar 200 mL de mídia rotulagem corante a cada poço. Incubar as amostras a 37 ° C, 5% CO ₂ por 30 minutos.
4. Enquanto as amostras são incubação, preparar solução Hoechst 33342 para a coloração nuclear das amostras através da mistura de 1 ml de Hoechst 33342, trihydrochloride, tri-hidratado (10 mg / ml solução em água, 16,2 mM solução; Sondas Invitrogen Molecular) em 10 ml de completo F-12K .
5. Remova a mídia de todas as amostras e adicionar 600 mL da solução de Hoechst diluir para cada amostra. Incubar as amostras a 37 ° C, 5% CO ₂ por 5 minutos.
6. Lavar três vezes com amostras de 600 mL de completo F-12K.
7. Incubar as amostras a 37 ° C, 5% CO ₂ por mais 30 minutos para permitir que fluoróforo unincorporated difundir para fora das células.
8. Após 30 minutos, altere os meios de comunicação nas amostras SNAP-Cell, uma última vez e vá para a imagem.
9. Imagem as células usando um microscópio Zeiss ApoTome Axiovert 200M fluorescente.

Resultados representante

Figura 1. Aqui estãoalguns resultados representativos das imagens fluorescentes por microscopia de fluorescência padrão de viver COS-7 células que estão expressando tag SNAP-fusões. Esta primeira imagem mostra ao vivo COS-7 células que expressam pSNAP-H2B (nuclear histona) marcada com SNAP-Cell TMR-Star. A construção pSNAP-H2B foi gerada usando o tag pSNAP-vetor (m). As células foram marcadas com SNAP-Cell TMR-Estrela por 30 minutos e contrastado com Hoechst 33342 (azul) para núcleos. A fluorescência rosa demonstra a sobreposição da fluorescência vermelha onde a proteína histona está presente, além da fluorescência azul indicando o núcleo. A expressão da proteína H2B é clara e facilmente identificados.

Figuras 2 e 3. Essas duas imagens seguintes mostram ao vivo COS-7 transfectadas transitoriamente com células-pSNAP ADRβ2.
As células foram marcadas com SNAP-Cell TMR-Star (vermelho) e contrastado com Hoechst 33342 (azul). A construção pSNAP-ADRβ2 foi gerada usando o tag pSNAP-vetor (m). As células foram marcadas com SNAP-Cell TMR-Estrela por 30 minutos e contrastado com Hoechst 33342 (azul) para núcleos. A fluorescência vermelha indica a presença de superfície celular ADRB2 proteína receptora de fluorescência azul, enquanto identifica o núcleo.

Discussão

Há diversas variáveis ​​que afetam os resultados observados, tais como foco intensidade do laser, a capacidade de equipamentos, lentes usadas, etc A fotoestabilidade do fluoróforo determina a rapidez com que a fluorescência deve ser capturado antes de desaparecer.

Este método de rotulagem proteína é versátil e adequada para muitas aplicações. SNAP-tag e CLIP tag tecnologias para a rotulagem específica de proteínas de fusão com sondas sintéticas permitem vários aspectos da função da proteína, incluindo uma variedade de processos dinâmicos em células vivas e em lisados ​​celulares. SNAP, CLIP, MCP e ACP-tag tecnologias oferecem versatilidade e simplicidade extraordinária para a imagem de proteínas em células vivas e fixos e para o estudo das proteínas in vitro. A criação de uma construção de um único gene produz uma proteína de fusão com a tag capaz de formar uma ligação covalente a uma variedade de grupos funcionais, incluindo fluoróforos, biotina, ou grânulos. A proteína de interesse devem ser clonados e expressos apenas uma vez e, em seguida, a fusão pode ser usado com uma variedade de substratos fluorescentes para diversas aplicações a jusante como a rotulagem de proteína simultânea no interior das células vivas, localização de proteínas e translocação, pulse-chase experimentos, estudos de internalização do receptor , rotulagem superfície seletiva de células, proteínas puxar para baixo os ensaios, a detecção de proteínas em SDS-PAGE, citometria de fluxo, de alto rendimento ensaios de ligação em placas de microtitulação, as experiências de interação biosensor, e FRET baseado em ensaios de ligação.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Células CHO-K1	ATCC	CCL-61
F-12K sem soro
Placa de câmara Lab-Tek II com lamínulas de borossilicato #1.5	Nalge Nunc international	155409	Lote: 100808-8-0
DMEM
H–chst 33342, tri-hidrocloreto, tri-hidratado (solução 10 mg/ml em água, solução 16,2 mM)	Invitrogen	H3570	470519
Microscópio fluorescente Zeiss Apotome Axiovert 200M	Carl Zeiss, Inc.
Transpass V	New England Biolabs	M2561S	0030709
Transpass D2	New England Biolabs	M2554S	0060802
SNAP-Cell TMR Star	New England Biolabs	S9105S	0010811
Plasmídeo controle pSNAP-ADBR2	New England Biolabs	N9178S	0010811
Plasmídeo controle pSNAP-H2B	New England Biolabs	N9179S	0010811