Preparação de Oligoméricas β-amilóide 1-42 Indução e de Impairment plasticidade sináptica em fatias do hipocampo

Resumo

Uma característica da doença de Alzheimer é a elevação da Aâ _1-42 Peptídeo. Aqui nós fornecemos um protocolo para a preparação de sintéticos Aâ _1-42 Oligômeros, que prejudica a potenciação de longo prazo no hipocampo, um celular correlato de memória. Este procedimento é útil para investigar os mecanismos de Aâ induzida screening de patologia e de drogas.

Resumo

Comprometimento de conexões sinápticas é provável que fundamentam as mudanças sutis que ocorrem amnésico nas fases iniciais da doença de Alzheimer s (AD). β-amilóide (Aâ), um peptídeo produzido em quantidades elevadas em AD, é conhecido por reduzir a potenciação de longa duração (LTP), um celular correlato de aprendizagem e memória. De fato, LTP deficiência causada por Aâ é um paradigma útil para o estudo experimental disfunções sinápticas em modelos AD e para triagem de drogas capazes de atenuar ou reverter tais deficiências sináptica. Estudos têm demonstrado que Aâ produz o rompimento LTP preferencialmente via sua forma oligomérica. Aqui nós fornecemos um protocolo detalhado para LTP prejudicando por perfusão de oligomerized sintéticos Aβ1-42 peptídeo em aguda fatias do hipocampo. Neste vídeo, descrevemos um procedimento passo-a-passo para a preparação de Aâ oligomérica

Protocolo

Ressuspensão peptídeo β-amilóide

Antes de começar tenho pronto:

• Aâ _1-42 (pó liofilizado)
• 1,1,1,3,3,3 Hexafluoro-2-Propanol (HFIP)
• Baixa ligação de polipropileno tubos de microcentrífuga (1,5 ml)
• Estanques Hamilton seringa com Teflon parar de mergulhar (250 mL)
• Dimetilsulfóxido (DMSO)

1. Permitir Aâ liofilizado _1-42 para equilibrar a temperatura ambiente por 30 minutos para evitar a condensação ao abrir o frasco peptídeo.
2. Sob o exaustor, re-suspender Aâ peptídeo _1-42 em HFIP gelada para obter uma solução 1 mM e vortex a solução por....

Discussão

Como descrito acima, vários problemas na preparação de Aâ oligomérica pode resultar em LTP intacta. Uma maneira de avaliar se a degradação Aâ ou a falta de oligomerização Aâ pode ter ocorrido é o de avaliar a preparação Aâ usando TRIS-tricine PAGE / análise de Western Blotting e ultracentrifugação analítica (não descritos neste protocolo). Quando ocidental Blotting amostras são preparadas em condições non-denaturing/non-reducing, uma preparação bem sucedida deve gerar uma assinatura Western Blotting com bandas correspon.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Aβ 1-42 (liofilizado)	American Peptide	62-0-80
1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-Propanol (HFIP)	Fluka	52517
Dissulfóxido de dimetila (DMSO)	Biotium, Inc.	90082
Tubos cónicos de polipropileno de 50 mL	Corning	05-538-67
Microtubos MaxyClear de 1,5 ml com recuperação máxima	Axygen Scientific	MCT-150-L-C
Solução salina tamponada com fosfato, pH 7,4	Invitrogen	10010-023
Seringas GASTIGHT de 250 μL	Hamilton Co	1725
Banho ultrassônico	Branson	3510
Sistema concentrador Savant SpeedVac	Vários	SC 110A