Preparação de Oligoméricas β-amilóide 1-42 Indução e de Impairment plasticidade sináptica em fatias do hipocampo

Resumo

Uma característica da doença de Alzheimer é a elevação da Aâ _1-42 Peptídeo. Aqui nós fornecemos um protocolo para a preparação de sintéticos Aâ _1-42 Oligômeros, que prejudica a potenciação de longo prazo no hipocampo, um celular correlato de memória. Este procedimento é útil para investigar os mecanismos de Aâ induzida screening de patologia e de drogas.

Resumo

Comprometimento de conexões sinápticas é provável que fundamentam as mudanças sutis que ocorrem amnésico nas fases iniciais da doença de Alzheimer s (AD). β-amilóide (Aâ), um peptídeo produzido em quantidades elevadas em AD, é conhecido por reduzir a potenciação de longa duração (LTP), um celular correlato de aprendizagem e memória. De fato, LTP deficiência causada por Aâ é um paradigma útil para o estudo experimental disfunções sinápticas em modelos AD e para triagem de drogas capazes de atenuar ou reverter tais deficiências sináptica. Estudos têm demonstrado que Aâ produz o rompimento LTP preferencialmente via sua forma oligomérica. Aqui nós fornecemos um protocolo detalhado para LTP prejudicando por perfusão de oligomerized sintéticos Aβ1-42 peptídeo em aguda fatias do hipocampo. Neste vídeo, descrevemos um procedimento passo-a-passo para a preparação de Aâ oligomérica

Protocolo

Ressuspensão peptídeo β-amilóide

Antes de começar tenho pronto:

• Aâ _1-42 (pó liofilizado)
• 1,1,1,3,3,3 Hexafluoro-2-Propanol (HFIP)
• Baixa ligação de polipropileno tubos de microcentrífuga (1,5 ml)
• Estanques Hamilton seringa com Teflon parar de mergulhar (250 mL)
• Dimetilsulfóxido (DMSO)

1. Permitir Aâ liofilizado _1-42 para equilibrar a temperatura ambiente por 30 minutos para evitar a condensação ao abrir o frasco peptídeo.
2. Sob o exaustor, re-suspender Aâ peptídeo _1-42 em HFIP gelada para obter uma solução 1 mM e vortex a solução por alguns segundos.
3. Usando um vidro herméticos seringa Hamilton com plug Teflon, dividem-se rapidamente a solução _1-42 / HFIP Aâ igualmente em três frascos de polipropileno e selar os frascos.
4. Os frascos são então incubadas por 2 horas para permitir monomerization Aâ. Em seguida, abra os frascos e concentrar a solução Aâ _1-42 HFIP / sob vácuo, usando uma centrífuga SpeedVac (800 g, temperatura ambiente) até um filme peptídeo claro é observado no fundo dos frascos. Verifique cuidadosamente a temperatura no interior da centrífuga SpeedVac para evitar a degradação de peptídeos (max 25 ° C).
5. Vedação dos frascos e armazenar as alíquotas a -80 ° C. Aâ filme pode ser armazenado por seis meses.
6. Re-suspender um filme de adição de DMSO para obter uma concentração de até 5 mM Aâ _1-42. Sonicado em banho-maria por 10 minutos para garantir a completa re-suspensão.
7. Alíquota deste Aâ 5mM _1-42 solução em frascos de polipropileno. Seal todos os frascos e armazená-los a -20 ° C. Alíquotas devem ser descongeladas apenas uma vez. Cuidado com a condensação de água dentro do freezer. Peptídeos em solução degradam muito facilmente.

Oligomerização

Antes de começar tenho pronto:

• Aâ _1-42 / DMSO (5mm)
• Tampão fosfato estéril
• Baixa ligação de polipropileno tubos de microcentrífuga (1,5 ml)
• Baixa ligação de polipropileno tubos de centrífuga (50 ml)

1. Diluir o Aâ obtidos 5mM _1-42 / DMSO alíquota com tampão fosfato estéril (até 100 l).
2. Vortex por 30 segundos e, em seguida, incubar por 12 horas a 4 ° C

Tratamento fatia hipocampal

Ao tratar fatias do hipocampo, que é importante para evitar a não-adesão específica peptídeo em provetas, tubos de superfícies de perfusão, ea câmara de gravação. Use preferencialmente de baixa ligação tubos de polipropileno e contêineres. Evitar o uso de objectos de vidro ou de plástico genérico-ware. Media de perfusão deve ser soro-albumina ou livre.

Perfusão Aâ

Antes de começar tenho pronto:

• Oligomerized Aâ _1-42
• Buffer de gravação (em mM: NaCl 124, KCl 4,4, 1 Na ₂ HPO _4, 25 NaHCO _3, 2 CaCl _2, MgCl 2 _2, e 10 de glicose)
• Gravação eletrofisiológicas set-up com câmara de interface
• Transversal fatias do hipocampo incubadas em tampão de gravação oxigenado durante pelo menos 90 minutos após a dissecção (T = 29 ° C; taxa de perfusão constante = 2 ml / minuto)

1. Imediatamente antes do experimento, diluir o Aâ oligomerized _1-42 alíquota para a concentração de trabalho adequadas (200 nM ou superior) em um tubo de polipropileno com pré-oxigenado buffer de gravação.
2. Perfundir a solução _1-42 Aâ por 20 minutos para as fatias antes da indução da plasticidade sináptica.

Indução de plasticidade e follow-up

1. Normalmente, o modelo mais amplamente utilizado da plasticidade sináptica é a LTP. Ela pode ser induzida através da estimulação tetânica de uma sinapse dada no hipocampo. Registramos respostas campo de sinapses entre projeções do Shaffer garantia e CA1 neurônios piramidais no radiatum estrato. Nosso estimulação tetânica consiste em um estímulo explosão teta que inclui três trens separados por intervalos de 15 segundos. Cada trem é composto de 10 rajadas de 5 Hz, onde cada explosão acarreta 5 pulsos de 100 Hz. Aplicar a estimulação tetânica imediatamente após a perfusão de Aâ oligomerized foi concluída.
2. Imediatamente após a estimulação tetânica voltar para perfusão com tampão de gravação normal. Manter uma taxa de perfusão constante, temperatura da câmara de gravação e oxigenação adequada durante toda a duração do experimento.

Resultados representante e possíveis problemas

O Aâ oligomerized acordo com o protocolo clássico de Stine et coll. ^1, gera monômeros Aâ e uma variedade de oligômeros de diferentes tamanhoss (dímero, trímero, etc) A perfusão de oligomerized Aâ _1-42 leva à LTP diminuiu em Aâ tratados com fatias comparação com fatias controle. Nas nossas condições experimentais, onde 3-5 meses de idade camundongos C57BL/6J machos são usados, LTP em 200 nM Aâ tratados com fatias está em 150% média dos valores de referência, duas horas após a estimulação tetânica, enquanto em fatias controle de valores LTP são em% média de 200-250 baseline2. Em alguns casos, o tratamento com Aâ pode falhar para reduzir LTP hipocampal. Vários erros críticos que podem ocorrer incluem filme de secagem excessiva durante a concentração Aâ e oligomerização incompleta. Perfusão Aâ em fatias do hipocampo pode ser outra fonte de preocupação por causa das propriedades físico-químicas do peptídeo Aâ em solução, que está propenso a não-específica de adesão aos plásticos. Solução de problemas destas questões é discutido abaixo.

Discussão

Como descrito acima, vários problemas na preparação de Aâ oligomérica pode resultar em LTP intacta. Uma maneira de avaliar se a degradação Aâ ou a falta de oligomerização Aâ pode ter ocorrido é o de avaliar a preparação Aâ usando TRIS-tricine PAGE / análise de Western Blotting e ultracentrifugação analítica (não descritos neste protocolo). Quando ocidental Blotting amostras são preparadas em condições non-denaturing/non-reducing, uma preparação bem sucedida deve gerar uma assinatura Western Blotting com bandas correspon...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Aβ 1-42 (liofilizado)	American Peptide	62-0-80
1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-Propanol (HFIP)	Fluka	52517
Dissulfóxido de dimetila (DMSO)	Biotium, Inc.	90082
Tubos cónicos de polipropileno de 50 mL	Corning	05-538-67
Microtubos MaxyClear de 1,5 ml com recuperação máxima	Axygen Scientific	MCT-150-L-C
Solução salina tamponada com fosfato, pH 7,4	Invitrogen	10010-023
Seringas GASTIGHT de 250 μL	Hamilton Co	1725
Banho ultrassônico	Branson	3510
Sistema concentrador Savant SpeedVac	Vários	SC 110A