Uma característica da doença de Alzheimer é a elevação da Aâ 1-42 Peptídeo. Aqui nós fornecemos um protocolo para a preparação de sintéticos Aâ 1-42 Oligômeros, que prejudica a potenciação de longo prazo no hipocampo, um celular correlato de memória. Este procedimento é útil para investigar os mecanismos de Aâ induzida screening de patologia e de drogas.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Preparação de Oligoméricas β-amilóide 1-42 Indução e de Impairment plasticidade sináptica em fatias do hipocampo
Neste artigo
Resumo
Resumo
Comprometimento de conexões sinápticas é provável que fundamentam as mudanças sutis que ocorrem amnésico nas fases iniciais da doença de Alzheimer s (AD). β-amilóide (Aâ), um peptídeo produzido em quantidades elevadas em AD, é conhecido por reduzir a potenciação de longa duração (LTP), um celular correlato de aprendizagem e memória. De fato, LTP deficiência causada por Aâ é um paradigma útil para o estudo experimental disfunções sinápticas em modelos AD e para triagem de drogas capazes de atenuar ou reverter tais deficiências sináptica. Estudos têm demonstrado que Aâ produz o rompimento LTP preferencialmente via sua forma oligomérica. Aqui nós fornecemos um protocolo detalhado para LTP prejudicando por perfusão de oligomerized sintéticos Aβ1-42 peptídeo em aguda fatias do hipocampo. Neste vídeo, descrevemos um procedimento passo-a-passo para a preparação de Aâ oligomérica
Protocolo
Ressuspensão peptídeo β-amilóide
Antes de começar tenho pronto:
- Aâ 1-42 (pó liofilizado)
- 1,1,1,3,3,3 Hexafluoro-2-Propanol (HFIP)
- Baixa ligação de polipropileno tubos de microcentrífuga (1,5 ml)
- Estanques Hamilton seringa com Teflon parar de mergulhar (250 mL)
- Dimetilsulfóxido (DMSO)
- Permitir Aâ liofilizado 1-42 para equilibrar a temperatura ambiente por 30 minutos para evitar a condensação ao abrir o frasco peptídeo.
- Sob o exaustor, re-suspender Aâ peptídeo 1-42 em HFIP gelada para obter uma solução 1 mM e vortex a solução por alguns segundos.
- Usando um vidro herméticos seringa Hamilton com plug Teflon, dividem-se rapidamente a solução 1-42 / HFIP Aâ igualmente em três frascos de polipropileno e selar os frascos.
- Os frascos são então incubadas por 2 horas para permitir monomerization Aâ. Em seguida, abra os frascos e concentrar a solução Aâ 1-42 HFIP / sob vácuo, usando uma centrífuga SpeedVac (800 g, temperatura ambiente) até um filme peptídeo claro é observado no fundo dos frascos. Verifique cuidadosamente a temperatura no interior da centrífuga SpeedVac para evitar a degradação de peptídeos (max 25 ° C).
- Vedação dos frascos e armazenar as alíquotas a -80 ° C. Aâ filme pode ser armazenado por seis meses.
- Re-suspender um filme de adição de DMSO para obter uma concentração de até 5 mM Aâ 1-42. Sonicado em banho-maria por 10 minutos para garantir a completa re-suspensão.
- Alíquota deste Aâ 5mM 1-42 solução em frascos de polipropileno. Seal todos os frascos e armazená-los a -20 ° C. Alíquotas devem ser descongeladas apenas uma vez. Cuidado com a condensação de água dentro do freezer. Peptídeos em solução degradam muito facilmente.
Oligomerização
Antes de começar tenho pronto:
- Aâ 1-42 / DMSO (5mm)
- Tampão fosfato estéril
- Baixa ligação de polipropileno tubos de microcentrífuga (1,5 ml)
- Baixa ligação de polipropileno tubos de centrífuga (50 ml)
- Diluir o Aâ obtidos 5mM 1-42 / DMSO alíquota com tampão fosfato estéril (até 100 l).
- Vortex por 30 segundos e, em seguida, incubar por 12 horas a 4 ° C
Tratamento fatia hipocampal
Ao tratar fatias do hipocampo, que é importante para evitar a não-adesão específica peptídeo em provetas, tubos de superfícies de perfusão, ea câmara de gravação. Use preferencialmente de baixa ligação tubos de polipropileno e contêineres. Evitar o uso de objectos de vidro ou de plástico genérico-ware. Media de perfusão deve ser soro-albumina ou livre.
Perfusão Aâ
Antes de começar tenho pronto:
- Oligomerized Aâ 1-42
- Buffer de gravação (em mM: NaCl 124, KCl 4,4, 1 Na 2 HPO 4, 25 NaHCO 3, 2 CaCl 2, MgCl 2 2, e 10 de glicose)
- Gravação eletrofisiológicas set-up com câmara de interface
- Transversal fatias do hipocampo incubadas em tampão de gravação oxigenado durante pelo menos 90 minutos após a dissecção (T = 29 ° C; taxa de perfusão constante = 2 ml / minuto)
- Imediatamente antes do experimento, diluir o Aâ oligomerized 1-42 alíquota para a concentração de trabalho adequadas (200 nM ou superior) em um tubo de polipropileno com pré-oxigenado buffer de gravação.
- Perfundir a solução 1-42 Aâ por 20 minutos para as fatias antes da indução da plasticidade sináptica.
Indução de plasticidade e follow-up
- Normalmente, o modelo mais amplamente utilizado da plasticidade sináptica é a LTP. Ela pode ser induzida através da estimulação tetânica de uma sinapse dada no hipocampo. Registramos respostas campo de sinapses entre projeções do Shaffer garantia e CA1 neurônios piramidais no radiatum estrato. Nosso estimulação tetânica consiste em um estímulo explosão teta que inclui três trens separados por intervalos de 15 segundos. Cada trem é composto de 10 rajadas de 5 Hz, onde cada explosão acarreta 5 pulsos de 100 Hz. Aplicar a estimulação tetânica imediatamente após a perfusão de Aâ oligomerized foi concluída.
- Imediatamente após a estimulação tetânica voltar para perfusão com tampão de gravação normal. Manter uma taxa de perfusão constante, temperatura da câmara de gravação e oxigenação adequada durante toda a duração do experimento.
Resultados representante e possíveis problemas
O Aâ oligomerized acordo com o protocolo clássico de Stine et coll. 1, gera monômeros Aâ e uma variedade de oligômeros de diferentes tamanhoss (dímero, trímero, etc) A perfusão de oligomerized Aâ 1-42 leva à LTP diminuiu em Aâ tratados com fatias comparação com fatias controle. Nas nossas condições experimentais, onde 3-5 meses de idade camundongos C57BL/6J machos são usados, LTP em 200 nM Aâ tratados com fatias está em 150% média dos valores de referência, duas horas após a estimulação tetânica, enquanto em fatias controle de valores LTP são em% média de 200-250 baseline2. Em alguns casos, o tratamento com Aâ pode falhar para reduzir LTP hipocampal. Vários erros críticos que podem ocorrer incluem filme de secagem excessiva durante a concentração Aâ e oligomerização incompleta. Perfusão Aâ em fatias do hipocampo pode ser outra fonte de preocupação por causa das propriedades físico-químicas do peptídeo Aâ em solução, que está propenso a não-específica de adesão aos plásticos. Solução de problemas destas questões é discutido abaixo.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Como descrito acima, vários problemas na preparação de Aâ oligomérica pode resultar em LTP intacta. Uma maneira de avaliar se a degradação Aâ ou a falta de oligomerização Aâ pode ter ocorrido é o de avaliar a preparação Aâ usando TRIS-tricine PAGE / análise de Western Blotting e ultracentrifugação analítica (não descritos neste protocolo). Quando ocidental Blotting amostras são preparadas em condições non-denaturing/non-reducing, uma preparação bem sucedida deve gerar uma assinatura Western Blotting com bandas correspon...
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Experimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pela Universidade Columbia IACUC.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pelo NIH National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) (NS049442).>
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Aβ 1-42 (liofilizado) | American Peptide | 62-0-80 | |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-Propanol (HFIP) | Fluka | 52517 | |
| Dissulfóxido de dimetila (DMSO) | Biotium, Inc. | 90082 | |
| Tubos cónicos de polipropileno de 50 mL | Corning | 05-538-67 | |
| Microtubos MaxyClear de 1,5 ml com recuperação máxima | Axygen Scientific | MCT-150-L-C | |
| Solução salina tamponada com fosfato, pH 7,4 | Invitrogen | 10010-023 | |
| Seringas GASTIGHT de 250 μL | Hamilton Co | 1725 | |
| Banho ultrassônico | Branson | 3510 | |
| Sistema concentrador Savant SpeedVac | Vários | SC 110A |
Referências
- Stine, W. B. Jr, Dahlgren, K. N., Krafft, G. A., LaDu, M. J. In vitro characterization of conditions for amyloid-beta peptide oligomerization and fibrillogenesis. J Biol Chem. 278, 11612-11622 (2003).
- Vitolo, O. V. Amyloid beta -peptide inhibition of the PKA/CREB pathway and long-term potentiation: reversibility by drugs that enhance cAMP signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 13217-13221 (2002).
- Puzzo, D. Picomolar amyloid-beta positively modulates synaptic plasticity and memory in hippocampus. J Neurosci. 28, 14537-14545 (2008).
- Lewczuk, P. Effect of sample collection tubes on cerebrospinal fluid concentrations of tau proteins and amyloid beta peptides. Clin Chem. 52, 332-334 (2006).
- Masliah, E. Mechanisms of synaptic dysfunction in Alzheimer's disease. Histol Histopathol. 10, 509-519 (1995).
- Cullen, W. K., Suh, Y. H., Anwyl, R., Rowan, M. J. Block of LTP in rat hippocampus in vivo by beta-amyloid precursor protein fragments. Neuroreport. 8, 3213-3217 (1997).
- Itoh, A. Impairments of long-term potentiation in hippocampal slices of beta-amyloid-infused rats. Eur J Pharmacol. 382, 167-175 (1999).
- Walsh, D. M. Naturally secreted oligomers of amyloid beta protein potently inhibit hippocampal long-term potentiation in vivo. Nature. 416, 535-539 (2002).
- Lambert, M. P. nonfibrillar ligands derived from Abeta1-42 are potent central nervous system neurotoxins. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 6448-6453 (1998).
- Gong, B. Ubiquitin hydrolase Uch-L1 rescues beta-amyloid-induced decreases in synaptic function and contextual memory. Cell. 126, 775-788 (2006).
- Trinchese, F. Inhibition of calpains improves memory and synaptic transmission in a mouse model of Alzheimer disease. J Clin Invest. 118, 2796-2807 (2008).
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
