Artigo de método

Two-Photon-Based fotoativação no Live Embriões Zebrafish

DOI:

10.3791/1902

⸱

24 de dezembro de 2010

 ,  , 
1Molecular Cell Biology, Weizmann Institute of Science

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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Microscopia multifotônica permite o controle de fótons de baixa energia com penetração profunda e fototoxicidade óptica reduzida. Descrevemos a utilização desta tecnologia para a rotulagem de células vivas em embriões de peixe-zebra. Este protocolo pode ser facilmente adaptado para foto-indução de várias moléculas sensíveis à luz.

Resumo

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Fotoativação de compostos alvo em um organismo vivo tem se mostrado uma abordagem valiosa para investigar vários processos biológicos, tais como o desenvolvimento embrionário, sinalização celular e fisiologia adulta. A este respeito, o uso de microscopia multi-fotão permite fotoativação quantitativa de um determinado agente luz responsivo em tecidos profundos em uma resolução única célula. Como embriões zebrafish são opticamente transparentes, o seu desenvolvimento podem ser monitorados in vivo. Essas características tornam o zebrafish um organismo modelo perfeito para controlar a atividade de uma variedade de agentes químicos e proteínas pela luz concentrada. Aqui nós descrevemos o uso de microscopia de dois fótons de induzir a ativação de fluoresceína quimicamente enjaulado, que por sua vez, permite-nos a seguir o destino de células em embriões vivos zebrafish. Nós usamos embriões expressando um marco vivo genética (GFP) para localizar e precisamente alvo as células de interesse. Este procedimento pode ser igualmente utilizado para a ativação induzida luz precisa de proteínas, hormônios, pequenas moléculas e outros compostos enjaulado.

Protocolo

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Nós descrevemos um protocolo de rotulagem célula usando a fluoresceína enjaulado, no entanto, outros foto-ativável corantes e as proteínas podem ser igualmente utilizados.

1. A injeção de fluoresceína Caged

  1. Preparar a solução estoque de 5% (5mg enjaulado-fluoresceína / 100 mL de KCl 0,2 M) de Dextran-conjugado 4,5-dimetoxi-2-nitrobenzyl (DMNB) enjaulado fluoresceína (10.000 MW dextran, aniônicos, Invitrogen, sondas moleculares, Carlsbad, CA , cat. não. D-3310). Alíquotas e armazenar em -20 ° C. Note-se que DMNB gaiolas fluoresceína é sensível à luz e deve ser mantido no escuro.
  2. Prepare uma calha de injeção feita de ag....

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Discussão

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Foto-ativável compostos são moléculas cuja função é mascarado, até que são iluminados com um comprimento de onda específico (geralmente UV), induzindo uma reação fotoquímica que converte as moléculas em um estado biologicamente ou quimicamente ativas. Essas sondas fornecem ferramentas muito poderosas na investigação em biologia celular, uma vez que a ativação pode ser controlado com precisão temporal e espacialmente, limitando a sua exposição à luz.

A vantagem significativa de microscopia mu.......

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Agradecimentos

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Agradecimentos são devidos a Genia Brodsky para a figura de gráficos; Vyacheslav Kalchenko, Douglas Lutz, e Leonid Roitman para aconselhamento e assistência técnica com o uncaging dois fótons; Maayan tahor e Suliman Elsadin de assistência técnica; Uwe Strahle por ter gentilmente cedido a linha de repórter e neurogenin1 Amos Gutnick para comentários a este manuscrito. A pesquisa no laboratório Levkowitz é apoiado pela Fundação Alemã-Israelense (concessão número 183/2007); Israel Science Foundation (Grant número 928/08) e da Harriet & Marcel Dekker Foundation. GL é um titular da Cátedra de Desenvolvimento de Carreira Tauro em Investigação Biomédica.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Fluoresceína "caged" conjugada com dextrana 4,5-dimetóxi-2-nitrobenzil (DMNB) (dextrana de 10.000 MW, aniônica)InvitrogenD-3310molecular probes
Agarose para sulco de injeção e placas revestidasSigma-AldrichA9539
Capilares de vidro de parede fina com filamentoWorld Precision Instruments, Inc.TW100F-6
Puxador de micropipetasSutter Instrument Co.P-97
Ponta MicroloaderEppendorf5242 956.003
Bomba pneumática de picolitrosWorld Precision Instruments, Inc.PV820
Feniltioureia (PTU)Sigma-Aldrich22290-9
Agarose de ponto de fusão baixo para montagem de embriõesUltra Pure LMP agarose16520100
Fragamentos Fab de fosfatase alcalina (AP) anti-fluoresceínaRoche Group11426338910
Fast RedRoche Group11496549001

Referências

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  1. Westerfield, M. The Zebrafish Book: Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Brachydanio rerio. , University of Oregon Press. (1995).
  2. Russek-Blum, N., Nabel-Rosen, H., Levkowitz, G. High resolution fate map of the zebrafish diencephalon. Dev Dyn. 238, 1827-1835 (2009).
  3. Russek-Blum, N.

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