Derivação de células-tronco do rato trofoblasto de blastocistos

Resumo

Neste vídeo, demonstramos o isolamento de blastocistos mouse ea derivação de células-tronco de blastocistos trofoblasto. Descrevemos também condições para a manutenção da propriedade de célula-tronco, bem como a indução de diferenciação em cultura.

Resumo

Especificação do trofectoderma é um dos eventos mais antigos diferenciação de desenvolvimento dos mamíferos. A linhagem trofoblasto derivados a partir da implantação medeia trofectoderma e gera a parte fetal da placenta. Como resultado, o desenvolvimento desta linhagem é essencial para a sobrevivência do embrião. Derivação de trofoblasto haste (TS) células de blastocistos mouse foi primeiramente descrita por Tanaka

Protocolo

Neste protocolo, descrevemos a preparação de blastocistos do mouse e do estabelecimento de linhas de células TS. Manipulações do mouse geral antes da coleta de blastocistos, incluindo a criação de acasalamento natural e na indução da ovulação super, basicamente, seguir o protocolo padrão ilustrado por Nagy et al. 2003 (pp146-150).

Derivação e manutenção das células TS

1. Cruz configuração cruzamento entre ratos de interesse.
2. Prepare fibroblastos embrionárias de camundongos (MEFs) como células alimentadoras. Dois dias antes da coleta de blastocistos, MEFs (2 x 10 ⁶ células) são banhados em 100 pratos m....

Discussão

Neste vídeo, demonstramos o processo de coletar E3.5 blastocistos de procedimentos uterino e experimental para estabelecer linhagens de células TS. Descrevemos também a condição para manter a stemness de células TS e induzir sua diferenciação em células diferenciadas. Dois passos fundamentais para obter linhagens de células pura TS são o tempo para desagregação conseqüência (passo 9) e processamento de primeira passagem (passo 11). Tem sido relatado que a primitiva endoderme células derivadas podem surgir na cultura, ap.......

Materiais

Reagentes

Médio TS:
RPMI-1640, 20% FBS, piruvato de sódio 1 mM, 100 mM beta-mercaptoetanol e 100 mg / ml de penicilina-estreptomicina.

Mitomicina C:
Dissolver 2 mg mitomicina C (Sigma M-0503) em 2 ml de PBS e adicione essa mistura de 2 ml em 200 ml de médio TS (10 ng / ml). Fazer 20 alíquotas (10 ml) e armazenar a -20 ° C até o uso. Adicionar uma alíquota por 100 placa mm.

Embrionárias de camundongos médio de fibroblastos-condição (MEF-CM):
Placa MEFs em 100 placas mm (1 x 10 ⁶ / placa). No dia seguinte, adicione 10 ml de meio de TS por prato e continuar a cultura por 48 horas. Recolher o meio de cultura, filtrá-los (0,45 mm) e armazenar a -20 ° C em 35 alíquotas ml. Descongelar cada alíquota, quando necessário, que pode ser armazenado a 4 ° C. O MEFs pode ser usado para se preparar para mais dois lotes da CM antes que eles se tornam confluentes.

PBS / BSA:
Dissolver BSA, fração V (Sigma A3311, de 0,1% (w / v)) em PBS (10 ml), através de um filtro de seringa de 0,45 milímetros de filtro e fazer um alíquotas ml em tubos de 1,5 ml. Armazenar a -70 ° C e descongelar um tubo quando necessário para preparar FGF4.

FGF4 (1000x):
Ressuspender liofilizado FGF4 (Sigma F8424, 25 mg) com 1 ml da solução de PBS / BSA. Misture bem e fazer 10 alíquotas (100 ml) em tubos de 1,5 ml e armazenar a -70 ° C. Descongelar cada tubo quando necessário e guardar o restante a 4 ° C, não re-congelar. Diluída 1000 vezes em meio TS para obter 1x FGF4 (25 ng / ml).

Heparina (1000x):
Ressuspender heparina (Sigma H3149, 10.000 unidades) em PBS para uma concentração final de 1 mg / ml (1000x). Fazer 100 ml alíquotas em tubos de 1,5 ml e armazenar a -70 ° C. Alíquotas descongelar quando necessário e guardar o restante a 4 ° C, não voltar a congelar. Diluir 1000 tempo em meio TS para obter 1x heparina (1 ng / ml).