In vivo Detecção de interações proteína-proteína em Micro-padrão Superfícies

Resumo

Este vídeo mostra experimentos com posterior análise de interações proteína-proteína através da utilização de micro-padrão superfícies. A abordagem oferece a possibilidade de detectar as interações de proteínas em células vivas e combina alta capacidade de processamento com a possibilidade de extrair informações quantitativas.

Resumo

Desvendar a rede de interação de moléculas

Protocolo

Impressão microcontact:

1. Cortar campo de micropattern do selo PDMS utilizando um bisturi
2. Lave o campo que contém o micropattern através de lavagem com etanol (100%) e água destilada.
3. Seque o selo PDMS com nitrogênio ou gás argônio.
4. Pipetar 50 ul BSA-Cy5 solução de trabalho (0,67 mg / ml) para o selo de PDMS para que o campo micropattern inteiro é coberto com a solução. Incubar por 30 min em temperatura ambiente.
5. Lavar o campo micropattern através de lavagem com Tampão fosfato salino (PBS) e água destilada.
6. Seque o PDMS com nitrogênio ou gás argônio.
7. Coloque o selo PDMS sob seu próprio peso sobre o centro de uma lamela epoxy revestido e incubar por 30 min à temperatura ambiente numa placa de Petri.
8. Rotular a posição do carimbo PDMS na parte traseira da lamela e tira o selo do slide com uma pinça.
9. Vara uma câmara de hibridação Seguro Selo sobre o campo microcontact-impresso na lamela. O rótulo de ajuda para localizar o centro do campo.
10. Pipetar 60 mL de solução de trabalho estreptavidina (50 mcg / ml) para a câmara de reação e incubar a amostra por 60 min em temperatura ambiente.
11. Lavar a amostra com 1 ml de PBS, adicionando o buffer em uma porta da câmara e removê-lo simultaneamente a segunda porta com uma bomba.
12. Pipetar 60 mL de solução de trabalho biotinilado anticorpo (10 mg / ml em PBS suplementado com 0,1% Tween 20; "PBST") para a câmara de reação e incubar por 60 min em temperatura ambiente.
13. Lavar a amostra com 1 ml PBST e, posteriormente, 1 ml de PBS, adicionando o buffer em uma porta da câmara e removê-lo novamente na segunda porta com uma bomba.
14. Armazenar as superfícies micropatterned em PBS no escuro à temperatura ambiente até que as células estão prontos para a semeadura.

Incubação de células na superfície micropatterned:

1. Cultivar células aderentes à confluência de 50% em um 3 centímetros placa de cultura de tecidos.
2. Separar células que expressam a isca presa e proteínas de interesse, com solução de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) e centrifugar 5 min a 1.000 rpm.
3. Desprezar o sobrenadante e dissolver o celular em meio de crescimento de acordo.
4. Centrifugar 5 min a 1.000 rpm.
5. Desprezar o sobrenadante e dissolver o pellet celular em meio de crescimento adequado.
6. Trocar o PBS da câmara de reação na lamela micropatterned em 60 mL da suspensão de células.
7. Criar uma câmara úmida por imersão uma almofada em água destilada estéril e colocá-lo na placa de Petri para evitar que a amostra de funcionamento a seco.
8. Incubar as células ao longo da noite a 37 ° C em uma atmosfera de 5% CO ₂ na superfície micropatterned.
9. Antes de analisar as células no microscópio, a troca do meio de solução de Hank s sal tamponado incluindo Ca ^{2 +} e Mg ^{2 +.}

Microscopia:

1. A lamínula é colocada sobre um suporte adequado ea morfologia das células é verificada em branco-luz.
2. A qualidade da BSA-Cy5 é marcada por padrões de excitação em 647 nm.
3. Micropadrões de proteína presa fluorescente (GFP ou YFP) são registrados a 488 ou 514 nm sob Total Internal Reflection excitação (TIR).

Resultados representativos:

Se não houver interação entre as proteínas-alvo em células cultivadas em uma superfície micropatterned, a presa vai seguir a redistribuição isca. O micropattern resultante pode ser visualizado pelo rótulo de fluorescência da proteína presa. Importante é que o contraste obtido fornece uma medida direta da força de interação (ver Figura 1). Portanto, uma simples avaliação da interação de duas proteínas torna-se possível - sem a necessidade de continuar a processar os dados medidos primária.

Figura 1. Rearranjo da isca na membrana plasmática de células vivas em dosagens diferentes de interação. Imagens TIR de células transfectadas com T24 (a) CD71-GFP em anticorpos CD71, (b) CD4 e YFP citosólica em CD4-anticorpo e (c) GPI-GFP-DAF em anticorpos CD59 microbiochips são mostrados. Os dados são característicos para a forte (a), não (b) ou interação fraca (c). (A) é reproduzida a partir de (Weghuber et al., No prelo), (b) a partir de (Schwarzenbacher et al., 2008).

Discussão

O vídeo que acompanha demonstra um método para a detecção de interações proteína-proteína na membrana plasmática de células vivas (Schwarzenbacher et al, 2008;. Brameshuber et al, 2009;.. Weghuber et al, in press). Em princípio, qualquer plataforma de microscopia TIRF baseada pode ser usado como sistema de leitura. Somente quando de alta sensibilidade é desejada (por exemplo, para a detecção de moléculas simples), microscópios avançados serão necessários. Para alcançar melhores resultados os seguintes pontos críticos durante o processo de preparação requerem uma atenção especial:

1. Solução de loja Cy5 estoque em condições escuras, para evitar o branqueamento do fluoróforo e preparar o BSA-Cy5 solução de trabalho imediatamente antes da impressão microcontact.
2. Tenha cuidado para não arranhar a micropattern no PDMS com a ponta da pipeta e incube a amostra em condições escuras, para evitar o branqueamento do fluoróforo.
3. Coloque a lamínula sobre uma almofada esterilizada para evitar que grudem da lâmina de vidro para a placa de Petri. Uma vez que o carimbo de PDMS se adere à lâmina de vidro, não movê-lo.
4. Evite bolhas de ar na câmara de reação e incubar a amostra em condições escuras, para evitar o branqueamento do fluoróforo.
5. Não deixe que a amostra seca por mais de 2 minutos para evitar a formação de cristais de sal.
6. Para o desprendimento das células não utilizar de tripsina, uma vez que irá unir o domínio extracelular de proteínas da membrana, até agora manifestado. Evitando tripsina será útil para proteínas com baixo índice de rotatividade para formar micropadrões imediatamente após fixação das células na superfície.
7. Controlar o número de células incubadas em um microscópio e certifique-se que as células não alcançam mais do que 30-50% confluência. Certifique-se que as células excessivo são removidos imediatamente, devido à fixação rápida de células na superfície revestidos com anticorpo.
8. Slides apenas com alta qualidade BSA-Cy5 padrões podem ser usados ​​para análise posterior.
9. Expressão estável da proteína fluorescente presa é preferível devido à maior número de células que podem ser analisados ​​por varredura.
10. Ajuste TIRF adequada é indispensável para visualizar padrões devido ao fundo citosólica.

A técnica de micro-padronização oferece diversas possibilidades para a análise das interações proteína-proteína. Em primeiro lugar, juntamente com a quantificação do local, espacialmente resolvidos interações proteína-proteína também a detecção de interações fracas ou indirecta é possível sem a desvantagem de dar um elevado número de falsos positivos ou negativos. Em segundo lugar, permite ao pesquisador analisar interações proteína-proteína na membrana plasmática de células vivas, que é difícil de conseguir por abordagens bioquímicas como a tela de 2 híbridos. Em terceiro lugar a abordagem permite a detecção de isca presa interações que são modulados por mudanças ambientais, como a temperatura, a presença de diferentes proteínas ou outras moléculas ou modificações pós-translacionais. Assim, o ensaio permite a moduladores de triagem de um par de interação dada no contexto de células vivas. Além disso, ao reduzir a densidade de superfície do ligante captura ou o uso de ligantes monovalentes, a análise do estado de repouso se torna possível. Finalmente, se adequado plataformas de digitalização são utilizados, o número de células analisadas é alta o suficiente para atender as demandas de alto rendimento das empresas farmacêuticas para a triagem de drogas (Ramm, 2005).