Culturas primárias neuronais do cérebro de Tarde Stage Drosophila pupas

Resumo

Este vídeo demonstra a preparação de culturas primárias de neurônios do cérebro de final de estágio Drosophila pupas. Pontos de vista de culturas vivas mostram crescimento de neuritos e imagem dos níveis de cálcio usando Fura-2.

Resumo

Neste vídeo, demonstramos a preparação de culturas primárias de neurônios do cérebro de final de estágio Drosophila pupas. O procedimento começa com a remoção dos cérebros de animais em 70-78 horas após a formação pupário. Os cérebros isolados são mostrados após incubação em breve papaína seguido por várias lavagens em soro livre de meio de crescimento. O processo de dissociação mecânica de cada cérebro em uma queda de 5 ul de mídia em uma lamela é ilustrado. Os axônios e dendritos dos neurônios pós-mitóticas são cisalhado off perto da soma durante a dissociação, mas os neurônios começam a regenerar os processos dentro de algumas horas de placas. Imagens mostram culturas vivas em dois dias. Neurônios continuar a desenvolver processos durante a primeira semana de cultura. Populações neuronais específicas podem ser identificadas em cultura usando GAL4 linhas a dirigir expressão tecido específico de marcadores fluorescentes, como GFP ou RFP. Gravações de células inteiras têm demonstrado que os neurônios cultivados forma funcional, espontaneamente ativa sinapses colinérgicas e GABAérgica. Um segmento pequeno vídeo ilustra a dinâmica do cálcio nos neurônios cultivados usando Fura-2 como um corante indicador de cálcio para monitorar transientes de cálcio espontânea e nicotina respostas evocadas de cálcio em um prato de neurônios cultivados. Estas culturas cérebro pupal são um sistema modelo útil em que as ferramentas genéticas e farmacológicas podem ser usados ​​para identificar os fatores intrínsecos e extrínsecos que influenciam a formação ea função de sinapses central.

Protocolo

Preparações antes do dia da cultura:

1. Fazer a solução de dissecar estéril.
2. Faça DMEM estéril e manter em alíquotas de 10 ml a 4 ° C por 2 semanas.
3. Tornar estéril DDM2 suplementos e congelar em 50 ou 100 mL alíquotas de 1 mês.
4. Faça ConA / laminina.
5. Lamínulas casaco.
   Opcional: Faça CNBM estéril e armazenar congelado por até 4 meses.

No dia da cultura

I. Preparar solução enzimática (ES), em capela de fluxo laminar

1. Coloque 5 ml de solução de dissecação (DS) em um tubo de centrífuga de 15 ml.
2. Pesar 0,8 mg de L-cisteína em um eppendorf ....

Discussão

Neurônios colhidos os cérebros de roedores embrionárias / pós-natal podem ser cultivadas em cultura de células primária onde se estendem neurites e formam conexões sinápticas funcionais. Métodos para a preparação dessas culturas estão bem estabelecidas e estudos em culturas de roedores neuronal têm desempenhado um papel fundamental na identificação de genes e fatores ambientais envolvidos na regulação da formação de sinapses e função (Banker e Goslin, 1991). Enquanto os neurônios do inseto a partir de uma variedade de espécies também podem .......

Materiais

Lamelas revestimento: Coloque lamínulas autoclavado numa placa de Petri 60 mm. Ul pipeta 5 de Con A / mix laminina em centro de cada lamela. Lugar em 37 C incubadora por 2 horas. Enxágüe lamínulas 3x com 100 ul de água autoclavada cada. Use a vácuo ligado a uma pipeta Pasteur estéril. Durante o último enxaguamento, pegar a lamela com uma pinça e seco ambos os lados. Transferência a lamela e uma placa de Petri de 35mm. Conservar à temperatura ambiente por até um mês.