Montagem de cérebros de Drosophila adulta: um método para preparar lâminas para imagens confocais

Este protocolo é um trecho de Kelly et al., Dissecção e coloração imunofluorescente de neurônios do corpo do cogumelo e fotorreceptores em cérebros adultos de Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2017).

1. Montagem de cérebros adultos de D. melanogaster em lâminas de microscópio e imagens

1. Construa um escorregador de "ponte". Posicione duas lamínulas de "base" a cerca de 1 cm de distância em uma lâmina carregada positivamente. Certifique-se de que o lado carregado positivamente do slide esteja voltado para cima. Cole as lamínulas na lâmina com esmalte de unha, conforme mostrado em Figura 1A. Geralmente, é útil selar as três bordas externas de cada lamínula de cobertura de base com esmalte de unha para garantir que a mídia de montagem não absorva essas lamínulas de cobertura de base. Deixe o esmalte secar completamente (10 - 15 min) antes de prosseguir.
2. Colocar a lâmina sob o estereomicroscópio e pipetar a solução do meio de montagem contendo os cérebros dissecados no espaço entre as duas lamínulas. Para fornecer mais contraste, é útil manobrar as luzes gooseneck para que fiquem paralelas ao tampo da bancada.
3. Remova a mídia de montagem extra da lâmina usando uma pipeta, tomando cuidado para não pipetar os miolos da lâmina.
4. Absorva a mídia de montagem extra. Isso permitirá que os cérebros sejam posicionados com mais precisão durante a próxima etapa.
5. Usando um par de pinças e o estereomicroscópio, posicione os cérebros na lâmina em um padrão de grade com os lobos antenais voltados para cima.
6. Coloque uma lamínula (a "ponte") sobre os cérebros (Figura 1A). Use esmalte para selar as laterais da lamínula da ponte onde elas entram em contato com as lamínulas da "base".
7. Usando uma pipeta p200, encha lentamente a cavidade central sob a ponte com um novo meio de montagem (Figura 1B). Coloque uma gota de cada vez na borda aberta da lamínula central e deixe a mídia de montagem passar por baixo da lamínula da ponte central. Continue até que toda a cavidade esteja preenchida com a mídia de montagem e, em seguida, sele a parte superior e inferior com esmalte transparente.
8. Quando o esmalte estiver seco, fotografe as lâminas imediatamente ou guarde-as em uma caixa de lâminas à prova de luz a -20 °C.
9. Dentro de uma semana, os cérebros de imagem usam um microscópio confocal de varredura a laser com lasers de excitação e cubos de filtro apropriados para os anticorpos secundários fluorescentes escolhidos. Imagens Z-stack de neurônios do corpo de cogumelo são normalmente obtidas usando objetivas de 20X ou 40X. A imagem dos neurônios fotorreceptores da retina pode exigir maior ampliação.

Figura 1: Montagem de cérebros em preparação para imagens de imunofluorescência. (A) Os cérebros são montados em slides SuperFrost Plus com uma tampa de ponte para evitar o achatamento dos cérebros. Duas lamínulas de cobertura "base" são coladas a uma lâmina Superfrost Plus carregada positivamente com esmalte transparente e cérebros dissecados são então colocados na lâmina entre elas. Uma lamínula de cobertura transparente em "ponte" é colocada acima do cérebro e aderida às lamínulas de cobertura da base. (B) Uma vez que o esmalte de unha secou, o Vectashield é lentamente pipetado sob a ponte para preservar a fluorescência do anticorpo secundário. O esmalte transparente é então usado para selar a parte superior e inferior da lamínula da "ponte". Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.