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Este protocolo é um trecho de Zhang et al, O intestino de C. elegans como modelo para morfogênese de lúmen intercelular e biogênese de membrana polarizada in vivo no nível de célula única: marcação por coloração de anticorpos, análise e imagem de perda de função de RNAi, J. Vis. Exp. (2017).
Coloração de anticorpos do intestino de C. elegans
- fixação
- Pegue uma lâmina de vidro limpa e use poli-L-lisina para gerar uma película fina para as minhocas grudarem. Coloque 30 μL de poli-L-lisina a 0,1-0,2% na lâmina e coloque uma segunda lâmina na gota de poli-L-lisina para fazer um "sanduíche". Em seguida, esfregue as lâminas suavemente algumas vezes para molhar todas as superfícies de ambas e deixe-as secar ao ar por 30 min. Rotule o lado fosco dos slides com lápis.
NOTA: Alíquotas de poli-L-lisina a 0,2% de 200 μL foram feitas dissolvendo o pó em dH2O; isso pode ser armazenado a -20 °C. Use poli-L-lisina de alto peso molecular para melhorar a aderência dos vermes. A concentração de poli-L-lisina também é crítica. Concentrações muito baixas não permitirão que os vermes grudem, mas concentrações muito altas podem gerar sinal de fundo de fluorescência. Uma película muito espessa pode se soltar em sua totalidade.
- Coloque um bloco de metal plano firmemente no fundo de um recipiente (por exemplo, um recipiente de poliestireno) cheio de nitrogênio líquido.
OBSERVAÇÃO: Pode-se usar gelo seco, mas o nitrogênio líquido mantém um bloco de metal mais estável no fundo do recipiente e esfria bem.
- Colete minhocas lavando-as de seus pratos com M9 ou escolha minhocas de diferentes estágios (ovos, vermes em estágio larval L1, L2, L3 ou L4) em cada lâmina. Normalmente, escolha ~ 100 larvas e embriões ou ~ 20 adultos para cada lâmina. Coloque 10 μL de minhocas lavadas no meio da lâmina ou pegue ovos/minhocas em 10 μL M9 ou 10 μL 1x PBS (solução salina tamponada com fosfato).
- Use uma pipeta para espalhar um grande número de minhocas para evitar aglomeração.
Nota: Populações mistas de vermes lavados, devido ao aglomerado e diferentes espessuras de estágios, não aderem bem e são menos efetivamente congeladas (veja abaixo), portanto, a colheita de vermes específicos do estágio (ou populações sincronizadas) dá resultados superiores. As larvas aderem melhor do que os adultos e mais animais podem ser colocados por lâmina.
- Antes de pegar minhocas em lâminas, transfira-as para uma placa de meio de crescimento de nematóides (NGM) sem bactérias OP50. O excesso de bactérias aderentes aos vermes também pode interferir na aderência. Tome cuidado para que os vermes não sequem.
- Coloque suavemente (solte) uma lamínula de 22 mm × 22 mm transversalmente em cima das minhocas coletadas, de modo que suas bordas fiquem penduradas em pelo menos um lado da lâmina. Pressione suavemente mas com firmeza com um ou dois dedos na lamínula. Evite cisalhamento que danifique a integridade do tecido.
- Transfira imediata e suavemente a lâmina para o bloco de metal em nitrogênio líquido e deixe descansar por cerca de 5 min para congelar. Em seguida, "sacuda" a lamínula em um movimento rápido usando a borda saliente.
OBSERVAÇÃO: Esta etapa deve ser feita de forma decisiva e enquanto a lâmina está congelada para conseguir a "rachadura" da cutícula. Cuidado: Siga as diretrizes de EPI (Equipamento de Proteção Individual) ao trabalhar com nitrogênio líquido.
- Mergulhe as lâminas rachadas por congelamento em um frasco de vidro Coplin cheio de metanol por 5 min a -20 °C. Em seguida, transfira para um frasco de vidro Coplin cheio de acetona por mais 5 min a -20 °C.
OBSERVAÇÃO: O metanol e a acetona devem ser armazenados a -20 °C durante pelo menos 30 minutos antes da utilização. Após a fixação, as lâminas podem ser armazenadas a -20 °C.
CUIDADO: metanol e acetona são tóxicos.
- Remova as lâminas do frasco e deixe-as secar ao ar em temperatura ambiente (RT) antes de usar.