Este protocolo foi extraído de Teoh et al, Abordagens quantitativas para estudar estruturas celulares e morfologia de organelas em Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2019).
Preparação de lâminas para imagem
- Prepare 3-4% p / v de caldo de agarose em uma garrafa própria para micro-ondas (3-4 g em 100 mL de água ultrapura).
OBSERVAÇÃO: O ágar pode ser usado no lugar da agarose na mesma concentração.
- Derreta a agarose cuidadosamente em um forno de micro-ondas, tomando cuidado para não ferver demais, até que toda a agarose se dissolva (solução límpida). Manter a solução a 70 °C para evitar a solidificação.
OBSERVAÇÃO: O caldo de agarose pode ser usado várias vezes. Reaqueça antes de usar se a agarose solidificar.
- Usando uma pipeta Pasteur, coloque uma gota de agarose derretida em uma lâmina de microscópio.
OBSERVAÇÃO: Evite bolhas de ar na gota de ágar, pois elas atrapalham a integridade da almofada.
- Pressione imediatamente a gota de agarose com outra lâmina de microscópio, achatando suavemente a agarose em uma almofada entre as duas lâminas.
OBSERVAÇÃO: Quaisquer bolhas restantes devem ser removidas nesta fase. Caso contrário, novos slides devem ser feitos, pois os animais podem facilmente ficar presos nas bolhas. Evite transbordar de ágar para o lado ao pressionar o slide.
- Deixe a agarose secar por 1 min.
- Separe cuidadosamente as duas lâminas para evitar danos à agarose, deixando a almofada solidificada em uma das lâminas.
OBSERVAÇÃO: As lâminas com almofadas de agarose devem sempre ser preparadas frescas antes do experimento, pois podem secar. Certifique-se de que a almofada de agarose tenha uma espessura consistente. Não deve haver bolhas de ar ou rachaduras na almofada, pois isso pode interferir na imagem.
- Adicione uma pequena gota (5-10 μL) de cloridrato de tetramisol a 0,05% (anestésico) no centro da almofada de agarose.
- Usando picareta esterilizada por calor, transfira rapidamente cerca de 10 a 15 animais da placa de estoque para a gota de anestésico antes que a solução seque. Evite transferir muitas bactérias OP50, pois isso torna a solução turva, o que pode interferir na imagem.
OBSERVAÇÃO: Se a solução anestésica secar durante a colheita, basta pipetar uma segunda gota de cloridrato de tetramisol a 0,05% nos animais. Os animais tendem a deitar de lado na solução anestésica.
- Aplique uma lamínula posicionando-a logo acima da almofada de agarose e soltando-a suavemente. Isso evitará a formação de bolhas. Não aplique pressão na lamínula, pois isso pode esmagar os animais.
- Rotule os slides com o nome da cepa.
