Overview
Dieses Video beschreibt die Drosophila-Ringdrüse, eine komplexe endokrine Struktur, die für die Biosynthese und Sekretion von Ekdysteroiden und anderen Hormonen wichtig ist. Das vorgestellte Protokoll demonstriert seine Zerlegung, Fixierung und Immunfärbung.
Protocol
Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Imura et al.,Protokolle zur Visualisierung steroidogener Organe und ihrer interaktiven Organe mit Immunostainierung in der Fruchtfliege Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2017).
HINWEIS: Das Gesamtschema der Protokolle ist in Abbildung 1dargestellt.
1. Die Zerlegung der Larval Ringdrüse (RG)
HINWEIS: In D. melanogaster, das zu cyclorrhaphous Diptera gehört, befindet sich das PG innerhalb eines zusammengesetzten endokrinen Organs, das Ringdrüse genannt wird (RG, Abbildung 2D). Da es nicht machbar ist, dass das PG operativ von anderen Zelltypen getrennt ist (später diskutiert), besteht ein praktisches Ziel darin, eine intakte, unbeschädigte RG durch Zerlegung zu isolieren.
- Vorbereitung von Larven in den entsprechenden Entwicklungsstadien
HINWEIS: Um die Entwicklungsstadien der D. melanogaster Larven zu synchronisieren, ist es notwendig, Eier innerhalb eines engen Zeitfensters zu sammeln und Larven zu den entsprechenden Zeiten zu sammeln.- Eier für 2 stunden auf einem Traubensaft-Agar-Teller bei 25 °C sammeln.
- Sammeln Sie frisch geschlüpfte 1m Instar Larven unter einem Sezieren mikroskop mit Zange und übertragen Sie sie auf eine kleine Durchstechflasche mit püriertem Standardhefe/Maismehl-Fliegenfutter.
HINWEIS: Das Alter der Larven wird durch "Stunden nach der Eiablage (hAEL)", "Stunden nach dem Schlüpfen (hAH)" oder "Stunden nach L3 ecdysis (hAL3E)" dargestellt. - Sammeln Sie die inszenierten Larven zum richtigen Zeitpunkt mit einer Einweg-Kunststoffschlaufe, um unerwünschte Verletzungen zu vermeiden. Um einen Unterschied in der Entwicklungsprogression der3. Instar-Larven zu minimieren, sammeln Sie die2. Instar-Larven bei 70 hAEL (48 hAH) und lassen Sie sie in 2 h Intervallen molt. Dann sammeln Sie die3. instar Larven innerhalb von 2 h nach der L3 ecdysis; dieses Verfahren ergibt 0-2 hAL3E Larven.
- Die inszenierten Larven auf eine mit Phosphat gepufferte Saline (PBS) gefüllte Schale übertragen.
- Spülen Sie die Larven mit PBS, um Restnahrung aus dem Körper zu entfernen.
- Grobe Sezierung von Larven unter einem Sezierendes Mikroskop
- Halten Sie den Mundhaken einer Larve mit Zange. Sever den Larvenkörper an der vorderen ein Drittel der Körperlänge mit Mikroschere.
- Halten Sie das geschnittene Ende des vorderen Larvenkörpers mit einem Paar Zangen. Mit dem anderen Paar Zange, drücken Sie sanft die Spitze des Kopfes in Richtung der Innenseite des Körpers; Dieses Verfahren dreht den Larvenkörper von innen nach außen.
HINWEIS: Dieser Schritt kann für die Zerlegung von 1m Instarlarven übersprungen werden. - Wiederholen Sie die Schritte 1.2.1-1.2.2 mit zusätzlichen Larven für 5-10 min.
HINWEIS: Die Anzahl der Larven sollte gleich oder weniger als 20 sein, um Zeit für die Zerlegung zu sparen.
- Fixierung und Färbung von Gewebe mit Immunhistochemie
- Legen Sie das vordere Drittel der Larvenkörper (Schritt 1.2.2) in ein 1,5 ml Mikrorohr, gefüllt mit 500 l der Fixlösung (4% Paraformaldehyd in PBS). Fix weniger als 20 Proben auf einmal, sonst PBS an die festen Proben angehängt kann eine ungünstige Verdünnung des Fixativs verursachen. Entfernen Sie bei der Verrundungssektion einen Abwurf von PBS, und fügen Sie dann einen Tropfen Fixlösung hinzu.
HINWEIS: Für fixe Lösungen können entweder 3,7 % Formaldehyd oder 4 % Paraformaldehyd verwendet werden. - Inkubieren Sie das sezierte Gewebe in der Fixlösung 30 min bei Raumtemperatur (RT) oder alternativ für 2 h bei 4 °C.
- Ersetzen Sie die Fixlösung durch 500 L PBS und spülen Sie die Proben schnell dreimal. Waschen Sie die Proben mit 500 l 0,3% PBT (PBS + 0,3% Octylphenolethoxylat) für 15 min auf einer Wippe bei RT. Für die Filetsektion entfernen Sie die Insektenstifte und übertragen Sie die Proben in ein 1,5 ml Mikrorohr.
HINWEIS: Zur Erhöhung der Durchlässigkeit von Antikörpern in Geweben werden die Proben mit 500 l 2,0% PBT für 1-2 h auf einer Wippe bei RT behandelt. - Ersetzen Sie PBT durch eine 500-L-Blockierlösung (2% Rinderserumalbumin in PBT). Inkubieren Sie die Proben für 1,5 h auf einer Wippe bei RT.
- Ersetzen Sie die Blockierlösung durch die primäre Antikörperlösung 50 l, d.h. Antikörper, die in der Blockierlösung verdünnt werden.
- Die Proben über Nacht auf einer Wippe bei 4 °C inkubieren.
- Ersetzen Sie die primäre Antikörperlösung durch 500 l 0,3% PBT und spülen Sie die Proben schnell 5 Mal. Waschen Sie die Proben 3 mal mit 500 l 0,3% PBT für jeweils 15 min auf einer Wippe bei RT.
- Ersetzen Sie 0,3 % PBT durch die sekundäre Antikörperlösung (dye-konjugierte Antikörper, die in der Blockierlösung verdünnt werden). Für die Kernfärbung wird der 50-L-Lösung 0,5 l 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 0,1 mg/ml-Stammlösung) zugesetzt. Die Proben auf einer Wippe für 2 h bei RT oder alternativ bei 4 °C über Nacht inkubieren.
HINWEIS: Halten Sie die Proben im Dunkeln. - Ersetzen Sie die Antikörperlösung durch 500 l 0,3% PBT und spülen Sie sie 5 Mal. Waschen Sie die Proben 3 mal mit 500 l 0,3% PBT für jeweils 15 min bei RT.
- Legen Sie das vordere Drittel der Larvenkörper (Schritt 1.2.2) in ein 1,5 ml Mikrorohr, gefüllt mit 500 l der Fixlösung (4% Paraformaldehyd in PBS). Fix weniger als 20 Proben auf einmal, sonst PBS an die festen Proben angehängt kann eine ungünstige Verdünnung des Fixativs verursachen. Entfernen Sie bei der Verrundungssektion einen Abwurf von PBS, und fügen Sie dann einen Tropfen Fixlösung hinzu.
- Feine Zerlegung des Brain-RG-Komplexes, der das PG und die Montage enthält
- Verwenden Sie eine Einwegpipetten, um die immunbefleckten Proben auf eine Schale zu übertragen, die mit 0,3% PBT gefüllt ist.
HINWEIS: Um unbequeme Blasen während der Zerlegung und Montage zu vermeiden, können 0,3% PBT durch PBS ersetzt werden. - Halten Sie unter einem Sezieren des Mikroskops den Nagel- oder Mundhaken mit einem Zangenpaar. Schneiden Sie mit einer 27 G-Nadel, die an einer 1 ml Spritze als "Messer" befestigt ist, die vordere Spitze der Speiseröhre und der Augenscheiben, um den Hirn-RG-Augen-Scheibenkomplex aus der Körperkulage zu entfernen.
- Trennen Sie die Speiseröhre und den Darm mit Zangen vom Hirn-RG-Augen-Scheibenkomplex. Da die Speiseröhre durch das Gehirn über der ventralen Nervenschnur (VNC) verläuft, ziehen Sie den Darm zur hinteren Seite heraus.
HINWEIS: Um zusätzliche imaginäre Scheiben aus den Proben zu entfernen, schneiden Sie die Verbindungen zwischen Gehirn, Augenscheiben und Beinscheiben mit einem Nadelmesser. - Wiederholen Sie die Schritte 1.4.1-1.4.4 für andere Proben.
HINWEIS: Um zu verhindern, dass Gewebeablagerungen an den Proben kleben, übertragen Sie jede fertige Probe auf eine andere saubere Schale, die mit 0,3 % PBT oder PBS gefüllt ist. - Übertragen Sie die Proben mit einer Mikropipette in die Mitte einer sauberen Glasrutsche.
HINWEIS: Für die2. oder3. Instar-Larven sollte das Ende einer Mikropipette-Spitze mit einer Rasierklinge abgeschnitten werden. - Richten Sie unter einem Sezierendes Mikroskop einzelne Proben mit Hilfe von Zangen auf ihre Dorsalseite aus.
HINWEIS: Die RG befindet sich auf der Rückenseite des Gehirns (Abbildung 2A). Diese Ausrichtung erleichtert die Spezifikation einzelner Proben während der Bildgebung. - Neigen Sie einen Glasschlitten und wischen Sie so viel überschüssiges PBT wie möglich ab. Legen Sie einen Tropfen Montagereagenz auf eine Seite des Schlittens. Legen Sie die Kante eines Deckelschlupf von der anderen Seite des Tropfens und legen Sie den Abdeckungsschlupf auf die Proben langsam mit Zangen.
HINWEIS: Dieses Verfahren verhindert, dass sich die Proben außerhalb des Deckbelegs bewegen. - Bewahren Sie die Proben bei 4 °C auf. Halten Sie die Proben im Dunkeln.
- Verwenden Sie eine Einwegpipetten, um die immunbefleckten Proben auf eine Schale zu übertragen, die mit 0,3% PBT gefüllt ist.
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Representative Results
Abbildung 1: Das Gesamtschema der Protokolle. Je nach Zweck der Experimente sind zwei unterschiedliche Seziermethoden auf Larven und erwachsene Weibchen anwendbar. Die Montagemethoden werden auch nach Probenbedingungen entwickelt. Befestigungs-, Färbe- und Bildgebungstechniken sind grundsätzlich in allen Proben üblich. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Visualisierung des PG und der PG-projizierten Neuronen. (A und B) Der Hirnringdrüse (RG) Komplex des Wildtyps 3rd instar larva. In (B) wird das PG durch gepunktete Linien umrandet. Die fadenförmige Struktur zwischen Gehirn und RG ist die Luftröhre. (C-E) Die Innervation des PG wurde mit mCD8::GFP von GMR45C06-GAL4 in FlyLight Kollektion gesteuert. Die PG- und GFP-positiven Neuronen wurden mit Anti-Sro-Antikörpern (Magenta) bzw. Anti-GFP-Antikörpern (grün) gekennzeichnet. Das fluoreszierende Bild wird mit dem Übertragen-Licht-Bild zusammengeführt, um die Umrisse von Geweben anzugeben. In (D) werden die PG, die Corpora allata (CA) und die corpora cardiaca (CC) dargestellt. Die PG-projizierten Neuronen sind im Hochleistungsbild mit 40-fachem Objektiv (Pfeile in E) prominenter als das Low-Power-Bild mit 10-Fachobjektiv (C). Maßstabsleiste = 100 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Egg collection | |||
| tissue culture dish (55 mm) | AS ONE | 1-8549-02 | for grape-juice agar plates |
| collection cup | HIKARI KAGAKU | ||
| yeast paste | Oriental dry yeast, Tokyo | ||
| 100% grape juice | Welch Food Inc. | ||
| rearing larvae | |||
| small vials (12ml, 40×23.5 mm, PS) | SARSTEDT | 58.487 | |
| disposable loop | AS ONE | 6-488-01 | |
| standard fly food | The recipe is on the website of Bloomington stock center. | ||
| Dissection | |||
| dissecting microscope | Carl Zeiss | Stemi 2000-C | |
| dissecting microscope | Leica | S8 AP0 | |
| tissue culture dish (35 x 10 mm, non-treated) | IWAKI | 1000-035 | |
| Sylgard | TORAY | coarting silicon inside dishes | |
| Terumo needle (27G, 0.40 x 19 mm) | TERUMO | NN-2719S | A "knife" to cut the tissue |
| forceps, Inox, #5 | Dumont, Switzerland | ||
| insect pin (0.18 mm in diameter) | Shiga Brand | for fillet dissection | |
| micro scissors | NATSUME SEISAKUSHO CO LTD. | MB-50-10 | |
| Fixation | |||
| ultrapure water | Merck Millipore | ||
| phosphate buffered saline (PBS) | |||
| Formaldehyde | Nacalai tesque | 16222-65 | |
| Paraformaldehyde | Nacalai tesque | 02890-45 | |
| Triton-X100 | Nacalai tesque | 35501-15 | |
| microtubes (1.5 ml) | INA OPTIKA | CF-0150 | |
| Incubation | |||
| As one swist mixer TM-300 (rocker) | As one | TM-300 | rocker |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | 9048-46-8 | |
| Primary antibody | |||
| anti-Sro (guinea pig), 1:1000 | |||
| anti-GFP (rabbit), 1:1000 | Molecular Probes | A6455 | Shimada-Niwa ans Niwa, 2014 |
| anti-GFP (mouse mAb, GF200), 1:100 | Nakarai tesque | 04363-66 | |
| anti-5HT (rabbit), 1:500 | SIGMA | S5545 | |
| anti-Hts 1B1 (mouse) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | 1B1 | |
| anti-DE-cadherin (rat), 1:20 | DSHB | DCAD2 | |
| anti-nc82 (mouse), 1:50 | DSHB | nc82 | |
| Secondary antibody | |||
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A-11008 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A-11001 | |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 conjugate | Life Technologies | A-11081 | |
| Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate | Life Technologies | A-21435 | |
| Alexa Fluor 546 dye-conjugated phalloidin | Life Technologies | A-22283 | |
| Mounting reagents | |||
| Micro slide glass | Matsunami Glass Ind.,Ltd. | SS7213 | |
| Square microscope cover glass | Matsunami Glass Ind.,Ltd. | C218181 | |
| FluorSave reagent (Mounting reagent) | Calbiochem | 345789 | |
| Transfer pipette 1 ml (Disposable dropper) | WATSON | 5660-222-1S | |
| Fly stocks | |||
| w; GMR45C06-GAL4 | from Bloomington Drosophila Stock Center. (#46260) | ||
| UAS–GFP; UAS–mCD8::GFP | gifts from K. Ito, The University of Tokyo. | ||
| w[1118] | |||
| w; phantom-GAL4#22/UAS-turboRFP | |||
| w; UAS-mCD8::GFP; TRH-GAL4 | Li, H. H. (2014) and Alekseyenko, O. V, Lee, C. & Kravitz, E. A. (2010) | ||
| w; UAS-mCD8::GFP | from Bloomington Drosophila Stock Center. (#32188) | ||
| yw;; nSyb-GAL4 | from Bloomington Drosophila Stock Center. (#51941) |
