Overview
このビデオでは、生合成とエキディステロイドおよび他のホルモンの分泌に重要な複雑な内分泌構造であるショ ウジョウバエ リング腺について説明します。注目のプロトコルは、その解剖、固定、および免疫染色を示しています。
Protocol
このプロトコルは、フルーツフライショウジョウバエメラノガスター、J.Vis. Exp.(2017)で免疫染色を有するステロイド性器官とそのインタラクティブ器官を視覚化するためのプロトコル、Imuraらからの抜粋である。
注: プロトコルの全体的なスキームを 図 1に示します。
1. ラーバルリング腺(RG)の解剖
注:D. メラノガスターでは、シクロラフォス・ディプテラに属し、PGは環腺と呼ばれる複合内分泌器官内にある(RG、図2D)。PGが他のタイプの細胞(後述)から外科的に分離することは不可能であるため、実用的な目標は、解剖によって無傷で損傷を受けていないRGを単離することです。
- 適切な発達段階での幼虫の準備
注:D.メラノガスター幼虫の発達段階を同期させるには、狭い時間枠内で卵を採取し、適切な時期に幼虫を採取する必要があります。- 25°Cのブドウジュース寒天プレートに2時間卵を集める。
- 鉗子で解剖顕微鏡の下で新しく孵化した1st インスター幼虫を収集し、マッシュ標準酵母/コーンミールフライフードを含む小さなバイアルに移します。
注: 幼虫の年齢は、「産卵後数時間(hAEL)」、「ハッチ(hAH)後の数時間」、または「L3エクジシス(hAL3E)の数時間後」で表される。 - 適切な時点で、望ましくない損傷を避けるために使い捨てプラスチックループでステージ幼虫を収集します。3番目 のインスター幼虫の発生進行の違いを最小限に抑えるために、70 hAEL(48 hAH)で2番目 のインスター幼虫を採取し、2時間間隔で溶融できるようにします。次に、L3の切除後2時間以内に3番目 のインスター幼虫を集める。この手順は、0-2 hAL3E幼虫を与える。
- ステージングされた幼虫をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で満たされた皿に移します。
- 体内から残留食品を除去するためにPBSで幼虫をすすい。
- 解剖顕微鏡下での幼虫の粗解剖
- 幼虫の口のフックを鉗子で持つ。マイクロハサミを使用して、体長の3分の1前に幼虫の体を切断します。
- 前幼虫体の切り端を1組の鉗子で保持します。他の鉗子を使って、頭の先端を体の内側に向かってそっと押し込みます。この手順は、幼虫の体を裏返しにします。
注: このステップは、第1 のインスター幼虫の解剖のためにスキップすることができる。 - ステップ 1.2.1~1.2.2 を追加の幼虫で5~10分間繰り返します。
注: 幼虫の数は、解剖のための時間を節約するために20以下でなければなりません。
- 免疫組織化学による組織の固定と染色
- 幼虫体の3分の1前(ステップ1.2.2)を、500 μLの固定溶液(PBSで4%パラホルムアルデヒド)で満たされた1.5 mLマイクロチューブに入れます。一度に20サンプル未満を修正し、それ以外の場合は、固定サンプルに付着したPBSは、固定剤の好ましくない希釈を引き起こす可能性があります。フィレット解剖の場合は、PBS のドロップを削除し、修正ソリューションのドロップを追加します。
注: 溶液を修正するために、3.7%ホルムアルデヒドまたは4%パラホルムアルデヒドが使用されてもよい。 - 解剖した組織を室温(RT)で30分間、または4°Cで2時間の場合は、溶液中の溶液中でインキュベートします。
- 500 μL PBS に置き換えて、サンプルを 3 回素早くすすぐにしてください。RTのロッカーで500 μL 0.3%PBT(PBS + 0.3%オクチルフェノールエトキシレート)で15分間洗浄します。フィレット解剖の場合は、昆虫ピンを取り外し、サンプルを1.5 mLマイクロチューブに移します。
注: 抗体の組織への透過性を高めるため、サンプルはRTのロッカーで1-2時間の500 μL 2.0%PBTで処理されます。 - PBTを500 μLブロッキング溶液(PBT中の2%ウシ血清アルブミン)に交換してください。RTのロッカーに1.5時間サンプルをインキュベートします。
- ブロッキング溶液を、一次抗体溶液、 すなわち ブロッキング溶液で希釈された抗体を50μLに置き換えます。
- 4 °Cのロッカーで一晩サンプルをインキュベートします。
- 一次抗体溶液を500 μL 0.3%PBTに交換し、サンプルを5回素早くリンスします。サンプルをRTのロッカーでそれぞれ15分間、500 μL 0.3%PBTで3回洗浄します。
- 0.3%PBTを二次抗体溶液(ブロッキング溶液で希釈した色素共役抗体)を50μLに交換してください。核染色の場合、0.5 μL 4',6-ジミジノ-2-フェニリンドール(DAPI,0.1 mg/mL ストック溶液)を50 μL溶液に添加します。サンプルをロッカーに2時間RTで、または代わりに4°Cで一晩インキュベートします。
注: サンプルを暗闇の中に保管してください。 - 500 μL 0.3% PBT に抗体溶液を交換し、5 回リンスします。サンプルをRTでそれぞれ15分間、500 μL 0.3%PBTで3回洗浄します。
- 幼虫体の3分の1前(ステップ1.2.2)を、500 μLの固定溶液(PBSで4%パラホルムアルデヒド)で満たされた1.5 mLマイクロチューブに入れます。一度に20サンプル未満を修正し、それ以外の場合は、固定サンプルに付着したPBSは、固定剤の好ましくない希釈を引き起こす可能性があります。フィレット解剖の場合は、PBS のドロップを削除し、修正ソリューションのドロップを追加します。
- PGと実装を含む脳RG複合体の微細解剖
- 使い捨てパイプを使用して、免疫染色サンプルを0.3%PBT充填した皿に移します。
注: 解剖および取付けの間の不便な泡を避けるために、0.3%PBTはPBSと置き換えることができる。 - 解剖顕微鏡の下で、1組の鉗子でキューティクルまたは口のフックを保持します。1mLの注射器に取り付けられた27G針を「ナイフ」として使用し、食道の前先端と眼球盤を切断し、脳-RG-アイディスク複合体を身体キューティクルから除去する。
- 食道と腸を鉗子で脳-RG-アイディスク複合体から分離する。食道は腹側神経コード(VNC)の上の脳を通過するので、後部側に腸を引き出す。
注: サンプルから余分なイマジナルディスクを取り除くために、針ナイフで脳、アイディスク、脚板の間の接続を切断します。 - 他のサンプルについては、手順 1.4.1 ~ 1.4.4 を繰り返します。
注: 組織の破片がサンプルに付着するのを防ぐために、完了した各サンプルを0.3%PBTまたはPBSで満たされた別のきれいな皿に移します。 - サンプルをマイクロピペットできれいなガラススライドの中央に移します。
注:2ndまたは3rdのインスター幼虫の場合、マイクロピペット先端の端部はカミソリの刃で切り捨てるべきである。 - 解剖顕微鏡の下で、鉗子を使用して個々のサンプルを後側に整列させます。
注: RGは脳の裏側に位置する(図2A)。このアライメントは、イメージング中の個々のサンプルの指定を容易にします。 - グラススライドを傾け、できるだけ多くの余分なPBTを拭き取ります。スライドの側面に取り付け試薬を一滴置きます。ドロップの反対側からカバースリップの端を置き、フォースでゆっくりとサンプルにカバースリップを置きます。
注: この手順により、サンプルがカバースリップの外側に移動するのを防ぎます。 - サンプルは4°Cで保存してください。 サンプルを暗闇の中に保管してください。
- 使い捨てパイプを使用して、免疫染色サンプルを0.3%PBT充填した皿に移します。
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Representative Results
図 1: プロトコルの全体的なスキーム。 実験の目的に応じて、2つの異なる解剖方法が幼虫と成人女性に適用可能である。取り付け方法もサンプル条件に応じて考案されます。固定、染色、およびイメージングの技術は、基本的にすべてのサンプルに共通です。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:PGとPG投影ニューロンの可視化(AおよびB)野生型3型インスター幼虫の脳環腺(RG)複合体。(B)では、PGは点線で囲まれています。脳とRGの間の糸状構造は気管である。(C-E)PGのインナーゼーションは、FlyLightコレクションのGMR45C06-GAL4によって駆動されるmCD8::GFPで視覚化されました。PGおよびGFP陽性ニューロンは、それぞれ抗Sro抗体(マゼンタ)および抗GFP抗体(緑色)で標識した。蛍光画像を透過光画像と結合して、組織の輪郭を指定します。(D)では、PG、コードラアラタ(CA)およびコーポラ・心臓ラ(CC)が図示されている。PG投影ニューロンは、10X対物レンズ(C)を有する低出力画像よりも、40X対物レンズ(Eの矢印)を有する高出力画像でより顕著である。スケールバー= 100 μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Egg collection | |||
| tissue culture dish (55 mm) | AS ONE | 1-8549-02 | for grape-juice agar plates |
| collection cup | HIKARI KAGAKU | ||
| yeast paste | Oriental dry yeast, Tokyo | ||
| 100% grape juice | Welch Food Inc. | ||
| rearing larvae | |||
| small vials (12ml, 40×23.5 mm, PS) | SARSTEDT | 58.487 | |
| disposable loop | AS ONE | 6-488-01 | |
| standard fly food | The recipe is on the website of Bloomington stock center. | ||
| Dissection | |||
| dissecting microscope | Carl Zeiss | Stemi 2000-C | |
| dissecting microscope | Leica | S8 AP0 | |
| tissue culture dish (35 x 10 mm, non-treated) | IWAKI | 1000-035 | |
| Sylgard | TORAY | coarting silicon inside dishes | |
| Terumo needle (27G, 0.40 x 19 mm) | TERUMO | NN-2719S | A "knife" to cut the tissue |
| forceps, Inox, #5 | Dumont, Switzerland | ||
| insect pin (0.18 mm in diameter) | Shiga Brand | for fillet dissection | |
| micro scissors | NATSUME SEISAKUSHO CO LTD. | MB-50-10 | |
| Fixation | |||
| ultrapure water | Merck Millipore | ||
| phosphate buffered saline (PBS) | |||
| Formaldehyde | Nacalai tesque | 16222-65 | |
| Paraformaldehyde | Nacalai tesque | 02890-45 | |
| Triton-X100 | Nacalai tesque | 35501-15 | |
| microtubes (1.5 ml) | INA OPTIKA | CF-0150 | |
| Incubation | |||
| As one swist mixer TM-300 (rocker) | As one | TM-300 | rocker |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | 9048-46-8 | |
| Primary antibody | |||
| anti-Sro (guinea pig), 1:1000 | |||
| anti-GFP (rabbit), 1:1000 | Molecular Probes | A6455 | Shimada-Niwa ans Niwa, 2014 |
| anti-GFP (mouse mAb, GF200), 1:100 | Nakarai tesque | 04363-66 | |
| anti-5HT (rabbit), 1:500 | SIGMA | S5545 | |
| anti-Hts 1B1 (mouse) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | 1B1 | |
| anti-DE-cadherin (rat), 1:20 | DSHB | DCAD2 | |
| anti-nc82 (mouse), 1:50 | DSHB | nc82 | |
| Secondary antibody | |||
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A-11008 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A-11001 | |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 conjugate | Life Technologies | A-11081 | |
| Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate | Life Technologies | A-21435 | |
| Alexa Fluor 546 dye-conjugated phalloidin | Life Technologies | A-22283 | |
| Mounting reagents | |||
| Micro slide glass | Matsunami Glass Ind.,Ltd. | SS7213 | |
| Square microscope cover glass | Matsunami Glass Ind.,Ltd. | C218181 | |
| FluorSave reagent (Mounting reagent) | Calbiochem | 345789 | |
| Transfer pipette 1 ml (Disposable dropper) | WATSON | 5660-222-1S | |
| Fly stocks | |||
| w; GMR45C06-GAL4 | from Bloomington Drosophila Stock Center. (#46260) | ||
| UAS–GFP; UAS–mCD8::GFP | gifts from K. Ito, The University of Tokyo. | ||
| w[1118] | |||
| w; phantom-GAL4#22/UAS-turboRFP | |||
| w; UAS-mCD8::GFP; TRH-GAL4 | Li, H. H. (2014) and Alekseyenko, O. V, Lee, C. & Kravitz, E. A. (2010) | ||
| w; UAS-mCD8::GFP | from Bloomington Drosophila Stock Center. (#32188) | ||
| yw;; nSyb-GAL4 | from Bloomington Drosophila Stock Center. (#51941) |
