Drosophila ( Drosophila ) Optogénétique : une méthode pour manipuler les circuits neuronaux

Overview

L’optogénétique permet l’utilisation de la lumière pour manipuler les neurones génétiquement modifiés pour exprimer des protéines spécifiques sensibles à la lumière dont l’activation de la lumière déclenche un changement dans l’état du neurone. Ici nous décrivons une approche optogénétique dans Drosophila utilisant l’opsin Channelrhodopsin2. Le protocole d’exemple comporte un essai optogénétique réglé pour étudier les circuits neuronaux derrière le comportement d’évasion de la mouche.

Protocol

Ce protocole est un extrait de de Vries et Clandinin, Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2013).

1. Générer des mouches channelrhodopsin

1. Cross UAS-ChR2 vole avec le pilote Gal4 de votre choix, nous utilisons G105-Gal4, qui est exprimé en neurones Foma-1 dans le lobe optique.
2. Pour éliminer la possibilité d’une réponse visuelle à la stimulation de la lumière bleue, les deux lignes de mouche sont dans un^{arrière-plan}w + norpA.
3. Résultat final: w⁺norpA; G105-Gal4/SAMU-ChR2 +
4. Après l’éclos des mouches adultes, mettre des femelles sélectionnées sur des aliments frais, complétées par 10 μM tout-trans-rétinien (un co-facteur requis pour ChR2) et protégé de la lumière, pendant 3 jours avant d’effectuer l’analyse comportementale.

2. Faire 10 μM All-trans-retinal Enhanced Food

1. Dissoudre 100 mg de rétine trans dans 17,6 ml d’éthanol à 95 % pour faire 20 mM rétinien. Protégez tout-trans-rétinien de la lumière en tout temps.
2. Faire fondre les aliments standard à la mouche de la semoule de maïs au micro-ondes et laisser refroidir jusqu’à ce qu’ils soient chauds au toucher.
3. Mélanger 50 μl de 20 mM tout-trans-rétinien en flacons de 10 ml d’aliments pour mouches.
4. Laissez refroidir les flacons et protégez-les de la lumière.

3. Équipement

1. Bouts de pipet : Les bouts standard de pipet de 1.000 μl sont coupés près de la pointe, créant un diamètre de pore d'~2.25 millimètres.
2. Plate-forme (voir figure 1).
   1. Une base Delrin, de 17 cm X 25 cm, a été construite avec des trous filetés à chaque coin pour s’adapter aux connecteurs de tuyau de refroidissement NPT de 1/4 po.
   2. Un support vertical, fabriqué à partir de Delrin, est fixé au centre de la base. Les dimensions globales sont de 25 mm X 40 mm X 65 mm (largeur X profondeur X hauteur). Une rainure de 10 mm de large s’étend sur toute la longueur du support, avec une vis de pouce en bas. Une plate-forme est fixée au haut du support, 25 mm X 40 mm X 10 mm, avec un trou de 3,5 mm de diamètre aligné avec la rainure dans le support.
3. Tableaux LED (voir figure 1).
   1. Quatre bras de tuyau de refroidissement, d’environ 18 cm de long, sont fixés à la base de la plate-forme à l’aide du connecteur du tuyau de refroidissement. Le tuyau de refroidissement n’est utilisé que comme support structurel et n’est pas utilisé à des fins de refroidissement.
   2. Des rainures bien espacées sont coupées dans le dernier morceau de housage de refroidissement de chaque bras pour apposer un évier thermique à l’extrémité de chaque bras.
   3. Une LED bleue Rebel Tri-Stars est montée sur chaque évier thermique à l’aide de ruban adhésif thermique prédé coupé. Un Carclo 18° Tri-lens est fixé à chaque Tri-Star.
   4. Les trois étoiles LED sont câblées aux conducteurs buckpuck DC et une alimentation électrique comme spécifié. Nous avons organisé notre set-up avec chaque BuckPuck alimenter deux Tri-Stars en série.
   5. L’illumination des quatre tri-étoiles LED à 700 mA a donné une irradiance de 713 W/m^{2 sur} notre plate-forme.
4. Caméra: La caméra est montée sur un petit trépied et axée sur le haut de la plate-forme.

4. Analyse comportementale

1. Anesthésier brièvement les mouches sur la glace.
2. Placez les mouches individuelles dans des pointes de pipet, à l’aide de ruban adhésif pour fermer les deux extrémités de la pointe.
3. Une fois que les mouches se sont réveillées et explorent activement la pointe du tuyau, retirez le ruban adhésif et placez un pipet dans la rainure dans le support vertical. L’équipage est utilisé pour fixer la pointe du tuyau en place et pour fermer le bas de la pointe.
4. Comme la mouche explore la pointe pipet (généralement 30 - 60 sec), commencer l’enregistrement de la caméra juste avant que la mouche émerge de la pointe sur la plate-forme.
5. Une fois que la mouche a émergé sur la plate-forme, attendez 1-2 secondes, et allumez les LED bleues. Utilisez une mise à jour pour mesurer manuellement l’heure jusqu’à ce que la mouche amorce le vol.

Representative Results

Figure 1 : Installation expérimentale montrant la plate-forme avec le support vertical et les quatre bras de refroidissement qui retiennent les puits de chaleur avec des tableaux LED qui leur sont apposés. (A) La mise en place sous éclairage ambiant. (B) La mise en place lorsque les LED sont éclairées. (C) Une vue rapprochée vers le haut d’une LED de Tri-Star sur l’évier de chaleur. (D) Un gros plan du Tri-Star avec le tri-objectif attaché. (E) Un schéma du circuit Buckpuck Driver et LED. (F) Diagramme de circuit pour le circuit BuckPuck et LED. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
All-trans Retinal	Advance Scientific Chemical Inc	R3041
Equipment
Heat Sink 9.2 C/W	Luxeonstar	LPD30-30B	30 mm square X 30 mm high
Carclo 18° Tri-Lens	Luxeonstar	10507
Blue Rebel LED on Tri-Star Base	Luxeonstar	MR-B0030-20T	470 nm, 174 lm @ 700 mA.
700 mA BuckPuck DC Driver	Luxeonstar	3021-D-E-700
Wiring Harness for BuckPuck Driver	Luxeonstar	3021-HE
Pre-cut thermal adhesive tape	Luxeonstar	LXT-S-12	20 mm Hex Base
Snap-Loc Coolant Hose, ¼" ID	McMaster-Carr	5307K49
Snap-Loc Coolant Hose Connector	McMaster-Carr	5307K39	¼" NPT Male
Laboratory Grade Switching Mode Programmable DC Power Supply	BK Precision	1698
Exilim camera	Casio	EX-FH20