ड्रोसोफिला ऑप्टोजेनेटिक्स: न्यूरोनल सर्किट में हेरफेर करने के लिए एक विधि

Overview

ऑप्टोजेनेटिक्स प्रकाश के उपयोग को न्यूरॉन्स में हेरफेर करने में सक्षम बनाता है जो आनुवंशिक रूप से विशिष्ट ऑप्सिन-प्रकाश-संवेदनशील प्रोटीन को व्यक्त करने के लिए इंजीनियर होते हैं जिनकी प्रकाश सक्रियण न्यूरॉन की स्थिति में बदलाव को ट्रिगर करती है। यहां हम ऑप्सिन चैनलरोडोप्सिन 2 का उपयोग करके ड्रोसोफिला में एक ऑप्टोजेनेटिक दृष्टिकोण का वर्णन करते हैं। उदाहरण प्रोटोकॉल में फ्लाई के भागने के व्यवहार के पीछे न्यूरोनल सर्किटरी का अध्ययन करने के लिए एक ऑप्टोजेनेटिक्स परख सेट है।

Protocol

यह प्रोटोकॉल डी वेरियों और क्लेडिनिन, ऑप्टोजेनेटिक उत्तेजना ऑफ एस्केप बिहेवियर इन ड्रोसोफिला मेलनोगेस्टर, जे विस एक्सपी (2013) का एक अंश है।

1. चैनलरोडोप्सिन मक्खियों को उत्पन्न करें

1. क्रॉस यूएएस-ChR2 आपके चुनने के Gal4 ड्राइवर के साथ उड़ता है, हम G105-Gal4 का उपयोग करते हैं, जो ऑप्टिक पालि में फोमा-1 न्यूरॉन्स में व्यक्त किया जाता है।
2. नीली रोशनी उत्तेजना के लिए एक दृश्य प्रतिक्रिया की संभावना को खत्म करने के लिए, दोनों फ्लाई लाइनें डब्ल्यू⁺नॉर्पा पृष्ठभूमि में हैं।
3. अंतिम परिणाम: डब्ल्यू⁺norpA; G105-Gal4/UAS-ChR2 +
4. वयस्क मक्खियों के बाद, ताजा भोजन पर चयनित महिलाओं को रखें, 10 माइक्रोन ऑल-ट्रांस-रेटिना (ChR2 के लिए आवश्यक सह-कारक) के साथ पूरक और व्यवहार परख करने से पहले 3 दिनों के लिए प्रकाश से संरक्षित।

2. 10 माइक्रोन ऑल-ट्रांस-रेटिना संवर्धित भोजन बनाएं

1. 20 मिलीग्राम रेटिना बनाने के लिए 95% इथेनॉल के 17.6 मिलीलीटर में सभी ट्रांस-रेटिना के 100 मिलीग्राम को भंग करें। सभी ट्रांस-रेटिना को हर समय प्रकाश से सुरक्षित रखें।
2. माइक्रोवेव में मानक कॉर्नमील फ्लाई फूड पिघलाएं, और छूने के लिए गर्म होने तक ठंडा होने दें।
3. फ्लाई फूड के 10 मिलीलीटर की शीशियों में 20 एमएम ऑल-ट्रांस-रेटिना के 50 माइक्रोन मिलाएं।
4. शीशियों को ठंडा होने दें और प्रकाश से सुरक्षित रखें।

3. उपकरण

1. पिपेट टिप्स: टिप के पास मानक 1,000 माइक्रोल पिपेट युक्तियां काटी जाती हैं, जिससे ~ 2.25 मिमी का पोर व्यास बनता है।
2. प्लेटफ़ॉर्म (चित्रा 1देखें)।
   1. एक Delrin आधार, 17 सेमी X 25 सेमी, प्रत्येक कोने में पिरोया छेद के साथ निर्माण किया गया था 1/4 फिट "NPT शीतलक नली कनेक्टर ।
   2. डेलरिन से बना एक ऊर्ध्वाधर धारक, आधार के केंद्र से जुड़ा हुआ है। समग्र आयाम 25 मिमी X 40 मिमी X 65 मिमी (चौड़ाई एक्स गहराई एक्स ऊंचाई) हैं। एक 10 मिमी चौड़ा नाली धारक की लंबाई चलाता है, नीचे एक अंगूठे पेंच के साथ । एक मंच धारक के शीर्ष से जुड़ा हुआ है, 25 मिमी X 40 मिमी X 10 मिमी, धारक में नाली के साथ गठबंधन 3.5 मिमी व्यास छेद के साथ।
3. एलईडी सरणी (चित्रा 1देखें) ।
   1. शीतलक नली के चार हथियार, ~ 18 सेमी लंबी, शीतलक नली कनेक्टर का उपयोग कर मंच आधार से चिपके हुए हैं। शीतलक नली का उपयोग केवल संरचनात्मक समर्थन के रूप में किया जाता है और इसका उपयोग ठंडा करने के उद्देश्यों के लिए नहीं किया जाता है।
   2. ठीक से दूरी वाले खांचे प्रत्येक हाथ के शीतलक होसिंग के अंतिम टुकड़े में काटे जाते हैं ताकि प्रत्येक हाथ के अंत तक एक गर्मी सिंक को प्रत्यय किया जा सके।
   3. एक नीले एलईडी विद्रोही त्रिकोणीय सितारों पूर्व कट थर्मल चिपकने वाला टेप का उपयोग कर प्रत्येक गर्मी सिंक के लिए मुहिम शुरू की है । एक कार्लो 18 ° ट्राई लेंस प्रत्येक त्रिकोणीय सितारा से चिपका है ।
   4. एलईडी त्रि-तारे बकपक डीसी ड्राइवरों और निर्दिष्ट के रूप में बिजली की आपूर्ति के लिए वायर्ड हैं। हमने श्रृंखला में दो त्रिकोणीय सितारों को शक्ति देने वाले प्रत्येक बकपॉक के साथ अपने सेट-अप की व्यवस्था की है।
   5. ७०० एमए पर सभी चार एलईडी त्रिकोणीय सितारों की रोशनी हमारे मंच पर ७१३ डब्ल्यू/एम² की एक किरण मिले ।
4. कैमरा: कैमरा एक छोटे से तिपाई पर रखा गया है और मंच के शीर्ष पर केंद्रित है।

4. व्यवहार परख

1. संक्षेप में बर्फ पर मक्खियों एनेस्थेटाइज।
2. टिप के दोनों सिरों को बंद करने के लिए टेप का उपयोग करके, व्यक्तिगत मक्खियों को पिपेट युक्तियों में रखें।
3. मक्खियों के जागने के बाद और सक्रिय रूप से पिपेट टिप की खोज कर रहे हैं, टेप को हटा दें और ऊर्ध्वाधर धारक में नाली में एक पिपेट रखें। थंबस्क्रू का उपयोग पिपेट टिप को सुरक्षित करने और टिप के नीचे बंद करने के लिए किया जाता है।
4. जैसे ही फ्लाई पिपेट टिप (आमतौर पर 30 - 60 सेकंड) की पड़ताल करती है, फ्लाई प्लेटफॉर्म पर टिप से उभरने से ठीक पहले कैमरा रिकॉर्डिंग शुरू करें।
5. फ्लाई के मंच पर उभरने के बाद, 1-2 सेकंड का इंतजार करें, और नीले एलईडी चालू करें। जब तक फ्लाई उड़ान शुरू नहीं करती है, तब तक मैन्युअल रूप से समय को मापने के लिए टाइमर का उपयोग करें।

Representative Results

चित्रा 1: वर्टिकल होल्डर के साथ मंच दिखाते हुए प्रायोगिक सेट-अप और एलईडी सरणी के साथ गर्मी सिंक रखने वाले चार कूलेंट होसिंग हथियार। (A)परिवेश रोशनी के तहत सेट-अप । (ख)एलईडी जगमग होने पर सेट-अप । (ग)हीट सिंक पर एक त्रिकोणीय सितारा एलईडी का एक करीबी दृश्य । (घ)ट्राई-स्टार का एक करीबी त्रिकोणीय लेंस संलग्न है । (ई)बकपक ड्राइवर और एलईडी सर्किट की एक योजनाबद्ध । (च)बकपक और एलईडी सर्किट के लिए सर्किट आरेख । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
All-trans Retinal	Advance Scientific Chemical Inc	R3041
Equipment
Heat Sink 9.2 C/W	Luxeonstar	LPD30-30B	30 mm square X 30 mm high
Carclo 18° Tri-Lens	Luxeonstar	10507
Blue Rebel LED on Tri-Star Base	Luxeonstar	MR-B0030-20T	470 nm, 174 lm @ 700 mA.
700 mA BuckPuck DC Driver	Luxeonstar	3021-D-E-700
Wiring Harness for BuckPuck Driver	Luxeonstar	3021-HE
Pre-cut thermal adhesive tape	Luxeonstar	LXT-S-12	20 mm Hex Base
Snap-Loc Coolant Hose, ¼" ID	McMaster-Carr	5307K49
Snap-Loc Coolant Hose Connector	McMaster-Carr	5307K39	¼" NPT Male
Laboratory Grade Switching Mode Programmable DC Power Supply	BK Precision	1698
Exilim camera	Casio	EX-FH20