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Este protocolo é um trecho de Tauc et al., Isolando células-tronco intestinais de Drosophila Midguts adulta por FACS para estudar o comportamento das células-tronco durante o envelhecimento, J. Vis. Exp. (2014).
NOTA: Se este protocolo for usado pela primeira vez para isolar ISCs por classificação FAC, os seguintes controles são obrigatórios para definir inicialmente os parâmetros FACS corretamente: Células dissociadas do intestino médio de Drosophila do tipo selvagem (por exemplo, w1118) sem Sytox. Células dissociadas do tipo selvagem (por exemplo, w1118) Drosophila midguts com Sytox (ver Etapa 3.6). Células dissociadas do intestino médio da linha de mosca esg-Gal4, UAS-GFP sem Sytox.
1. Preparação de soluções e pratos para dissecção intestinal
- Prepare 4-6 frascos para injetáveis, cada um contendo 40 moscas fêmeas da linha de moscas esg-Gal4, UAS-GFP.
- A partir de uma solução estoque de PBS 10x, prepare 500 ml 1x PBS (1,8 mM NaH,2PO,4 · H,2O, 8,4 mM Na,2HPO,4 · 2H,2O, 175 mM NaCl, ajuste o pH para 7,4).
- Prepare uma solução de agarose a 3,5% em 1x PBS (3,5 g de agarose grau eletroforese em 100 ml 1x PBS). Prepare as placas de dissecação despejando esta solução em placas de Petri (diâmetro de 8,5 cm) para cobrir o fundo. A camada de agarose evita danificar as pontas da pinça durante o procedimento de dissecção. Após a solidificação do gel, armazenar as placas de dissecação a 4 °C.
- Prepare 300 ml de 1x PBS + 1% BSA fresco antes de dissecar e coloque o frasco no gelo ou a 4 °C.
- Ligue a centrífuga e deixe esfriar até 4 °C.
- Acenda as pontas de 2 pipetas Pasteur de vidro para alisar as bordas.
- Limpe dois pares de pinças e uma lâmina de barbear com etanol a 70%.
- Coloque quatro a seis tubos de microcentrífuga de 1,5 ml para coletar intestinos médios dissecados no gelo.
2. Preparação do Trato Gastrointestinal e Dissecção do Intestino Médio
- Anestesie as moscas de um frasco (40 moscas) com CO2 em um leito de mosca padrão, decapite todas as moscas usando uma lâmina de barbear e transfira-as para o prato de dissecação. Despeje a solução fria de 1x PBS/1% BSA no prato de dissecação para cobrir o gel de agarose. As moscas vão flutuar.
- Agarre o abdômen da mosca com um par de pinças, enquanto segura o tórax com o outro par de pinças. Separe o tórax do abdômen. O intestino ficará visível e o intestino anterior provavelmente ainda estará conectado ao tórax.
- Pegue o intestino e puxe-o para fora do tórax. Para desdobrar o intestino, pegue a colheita e puxe o intestino ligeiramente anteriormente para longe do abdômen.
- Agarre a extremidade posterior do abdômen com um par de pinças e a borda da cutícula aberta anteriormente com o outro par de pinças. Tenha cuidado para não destruir o tecido intestinal saliente. Puxe a extremidade posterior para quebrar a cutícula e continue puxando posteriormente com muito cuidado até que todo o intestino tenha sido puxado para fora da cavidade abdominal. A colheita pode ter que ser removida com antecedência se for muito grande para caber na cavidade do corpo.
- Remova o intestino anterior, os túbulos de Malpighi, o intestino posterior e os ovários, deixando o intestino médio nu
.
- Usando uma pipeta de vidro Pasteur, transfira o lote de intestinos médios dissecados para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml contendo solução fria de PBS 1x / BSA a 1% e mantenha o tubo no gelo. As amostras devem ser processadas dentro de 2 horas.
- Após a conclusão da dissecação de um lote inteiro, enxágue o prato de dissecação com água destilada dupla para lavar os restos de detritos. Comece a dissecar o próximo lote de intestinos médios (repita as etapas 2.1 a 2.7). Disseque o maior número possível de lotes em 2 horas e prossiga para a Etapa 3.1.
3. Digestão do tecido intestinal para colher células para classificação FAC
- Remova a solução 1x PBS/1% BSA do intestino médio e adicione 500 μl de solução de tripsina-EDTA a 0,5% a cada amostra.
- Vortex bem por 20 segundos e incube as amostras balançando/girando suavemente a 20 rpm em temperatura ambiente por 25-30 min.
- Vortex novamente após cerca de 30 min e deixe o tecido intacto do intestino médio afundar no fundo do tubo. Remover cuidadosamente as células que estão em suspensão com uma pipeta de vidro inflamado Pasteur e filtrá-las através de uma malha de nylon de 35 μm para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
- Gire as células para baixo a 100 x g por 5 min a 4 ° C. É importante observar que, ao iniciar a digestão, um pellet de célula pode não ser visível no início, mas se tornará visível à medida que a digestão do tecido progride.
- Transfira cuidadosamente a solução de tripsina de volta para o tubo de amostra original contendo o tecido intacto restante do intestino médio. Evite transferir muitas células do pellet.
- Ressuspenda suavemente o pellet celular em 400 μl de frio 1x PBS/1% BSA. Mantenha os tubos de microcentrífuga contendo as células dissociadas no gelo e cubra os tubos com papel alumínio para proteger as células da luz.
- Vortex a solução de tripsina contendo o tecido intestinal médio intacto restante novamente e coloque as amostras no balancim por mais 30 minutos em temperatura ambiente.
- Repita as etapas 3.3 a 3.4.3 até que todo o tecido do intestino médio tenha sido digerido. Combine as células dissociadas de todos os tubos de microcentrífuga em um tubo de microcentrífuga. Isto pode exigir uma etapa de centrifugação como no ponto 3.4, uma vez que o volume de todas as suspensões celulares combinadas pode exceder 1,5 ml. Mantenha a suspensão celular no gelo e proteja as células da luz.
- Gire as células dissociadas para baixo a 100 x g por 5 min a 4 ° C. Remova cuidadosamente o máximo possível do sobrenadante, deixando aproximadamente 50-100 μl da solução 1x PBS / 1% BSA no tubo da microcentrífuga. Ressuspenda suavemente as células dissociadas em 800 μl 1x PBS / 1% BSA contendo Sytox (1:20.000).
- Transfira a suspensão celular para um tubo Falcon de fundo redondo de 5 ml, filtrando as células através de uma tampa de pressão do filtro celular (malha de nylon de 35 μm). Sempre mantenha as amostras de células no gelo e protegidas da luz. As células agora estão prontas para serem classificadas.
- Pipetar 600 μl de solução de RNAlater em cada tubo de microcentrífuga no qual as células serão classificadas para posterior isolamento de RNA. Para outras aplicações a jusante, as células podem ser coletadas em uma solução diferente, por exemplo, em PBS estéril.