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O protocolo a seguir é um trecho de Cornwell et al, O Método do Conjunto de Réplicas: Uma Abordagem de Alto Rendimento para Medir Quantitativamente a Vida Útil de Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2018).
1. Prevenção da produção de progênie pela adição de 5-Fluoro-2'-desoxiuridina (FUdR)
- Cultivar animais até o estágio L4 a 20 °C. Verificar se os animais sincronizados evoluíram para L4 aproximadamente 40 h após a semeadura (etapa 2.1.7).
NOTA: O tempo de desenvolvimento de C. elegans varia em diferentes temperaturas e as taxas de crescimento de animais mutantes para os quais as taxas não foram caracterizadas devem ser testadas empiricamente.
- Adicionar 160 μL de 50x FUdR a cada placa de 6 cm com animais L4.
OBSERVAÇÃO: É fundamental adicionar FUdR no estágio L4. Por conveniência, faça 1.000 estoques de FUdR dissolvendo 1 g de FUdR em 10 mL de H2O ultrapuro. Esterilize o estoque de FUdR com um filtro de 0,2 μm e uma seringa de 10 cc. Alíquota ~ 1 mL de estoque em tubos estéreis de 1,5 mL. Congelar e conservar a -20 °C.
- Inspecione as placas quanto à presença de machos de C. elegans. Remova todos os machos.
OBSERVAÇÃO: A expectativa de vida é normalmente medida para hermafroditas e não para machos. Os hermafroditas que acasalam vivem menos do que os animais não acasalados, mesmo na presença de FUdR. Os machos são menores e mais magros que os hermafroditas e podem ser facilmente identificados por uma cauda em forma de gancho distinta.
- Coloque a caixa de volta no saco zip-lock. Retorne à incubadora de 20 °C.
2. Viabilidade de pontuação
- Marque a viabilidade diariamente tocando suavemente o animal na cabeça com um fio de platina ou cílios. Marque os animais que não conseguem se mover como mortos e remova-os do prato (Figura 1A). Registre o número de mortos observados para cada condição para cada ponto de tempo de observação.
OBSERVAÇÃO: Para reduzir o risco de viés de pontuação, o experimentador deve permanecer cego para as condições experimentais e, da mesma forma, não deve fazer referência aos resultados de pontos de tempo anteriores durante a pontuação.
- Censure os animais que se rompem, morrem de outros defeitos óbvios de desenvolvimento ou rastejam para o lado do prato: remova esses animais e registre o número em cada ponto de tempo observado para consideração na análise estatística. Além disso, se forem encontrados machos, remova-os e registre o número observado.
- Repita a partir do passo 2.1 diariamente até que nenhum animal permaneça vivo.
OBSERVAÇÃO: Se o gramado de E. coli diminuir significativamente ou o fungo começar a crescer na placa, transfira todos os animais restantes para uma nova placa com o RNAi e FUdR apropriados.
