$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Este protocolo é um trecho de Possik e Pause, Medindo a resistência ao estresse oxidativo de Caenorhabditis elegans em placas de microtitulação de 96 poços, J. Vis. Exp.(2015).
1. Realização do ensaio de resistência ao estresse oxidativo
- Pipetar 40 μl da solução de PQ a 100 mM (preparada fresca) para cada alvéolo de uma placa de 96 poços. Use pelo menos 12 poços como réplicas de cada condição (tratamento, mutante, etc.). Usando uma picareta de verme de fio de platina, transfira 5-8 larvas L4 para cada poço, indicando a hora de início e a hora de término.
- Ao iniciar outra condição, anote a hora de início e a hora de término. Colocar a placa a 20 °C no tempo de incubação entre a transferência das minhocas e a marcação dos animais mortos, uma hora mais tarde, a partir da hora de início.
- Usando o microscópio de dissecação, conte a sobrevivência a cada hora. Agite suavemente a placa antes de começar a contar. Indique vermes que não se movem, mesmo depois de detectar uma luz de alta intensidade, como animais mortos. Indique também o número de animais vivos.
OBSERVAÇÃO: Observar a forma do verme, as caudas e o movimento da cabeça em alta ampliação ajuda a determinar os vermes mortos dos vivos.
- Repita esta etapa a cada hora até que a maioria dos vermes esteja morta.
2. Determinação da porcentagem de sobrevivência em cada ponto de tempo
- Calcule o número total de animais por condição somando o número total de animais transferidos para cada poço. Ignore os animais que são danificados ou mortos durante a transferência.
- Para cada ponto de tempo, calcule o número total de animais mortos por condição (soma dos animais mortos nos 12 poços). Para cada ponto no tempo, calcule a porcentagem de morte (número de animais mortos dividido pelo número total de animais e multiplicado por 100) e a porcentagem de sobrevivência (100 menos a porcentagem de morte).
- Repita este ensaio pelo menos 3 vezes independentes.