Digestão enzimática e dissociação manual: um método para preparar embriões de C. elegans para cultura de células

Resumo

Fonte: Sangaletti, R. e Bianchi, L. Um método para cultura de células embrionárias de C. elegans.J. Vis. Exp.(2013).

Este vídeo apresenta um método para isolar e cultivar células embrionárias de C. elegans in vitro para isolar e cultivar estérilmente.

Protocolo

1. Dissociação de células embrionárias

1. Conduza as próximas etapas do procedimento em condições estéreis usando uma capela de fluxo laminar. Enquanto os animais são vestidos em placas de bactérias, as lavagens e o tratamento com a solução de lise contendo alvejante devem eliminar a maioria, senão todas as bactérias. Assim, o uso de uma capela laminar neste ponto do procedimento evita uma nova contaminação da suspensão do ovo.
2. Ressuspenda os ovos peletizados em 1 ml de quitinase 2 mg/ml (estoque em tampão de ovo pH 6,5) e transfira-os para um novo tubo cônico estéril de 15 ml. Balance o tubo por 10-30 min em temperatura ambiente. O tempo exato de incubação varia de acordo com o frescor da enzima e a temperatura da sala e, portanto, deve ser determinado para cada preparação. Recomenda-se iniciar o monitoramento dos ovos em microscópio de cultura de células invertido após 10 min de incubação. Nota: em nossa experiência, o pH baixo aumenta a atividade enzimática da quitinase. Por esse motivo, usamos tampão de ovo em pH 6,5 para dissolver a quitinase (receita relatada acima, onde o pH é ajustado para 6,5 usando NaOH).
3. Quando ~ 80% das cascas dos ovos forem digeridas pelo tratamento com quitinase (Figuras 1 AB), pelete os ovos por centrifugação a 900 x g (~ 2.500 rpm) por 3 min. Usando um pipetador P1000 e pontas estéreis, remova cuidadosamente o sobrenadante e adicione 3 ml de meio L-15.
4. Transferir os ovos para uma placa de 6 cm de diâmetro e dissociar suavemente as células utilizando uma seringa estéril de 10 ml equipada com uma agulha de 18 G. Monitore o grau de dissociação colocando uma gota de suspensão em uma placa de Petri de plástico fresco e visualizando ao microscópio. Não aspire ar para a seringa durante este procedimento para evitar danificar as células. Continue a dissociação até ~ 80% das células estarem dissociadas.
5. Filtrar a suspensão com um filtro Millipore estéril de 5 μm. As suspensões celulares devem ser filtradas para remover aglomerados de células, ovos não digeridos e larvas eclodidas. Filtre 4-5 ml adicionais de meio L-15 fresco através do filtro para recuperar todas as células. Não use força excessiva durante a etapa de filtração para evitar danificar o filtro e/ou as células.

2. Células de cultura

1. Pulverize as células dissociadas por centrifugação a 900 x g (~ 2.500 rpm) por 3 min. Usando um pipetador P1000 e pontas estéreis, remova cuidadosamente todo o sobrenadante. Ressuspenda as células peletizadas em meio L-15 completo e coloque 1 ml/alvéolo. A quantidade do meio adicionado depende do número de 8P placas usadas, a confluência dos vermes nas placas e o tipo de experimentos que serão realizados nas células. A densidade celular pode ser determinada usando um hemocitômetro. Para gravações patch-clamp, a densidade de revestimento de ~ 230.000 células/^cm2 é ideal.
2. Mantenha a placa de 24 poços em um recipiente plástico Tupperware contendo toalhas de papel molhadas para evitar a evaporação do meio de cultura. Armazene o recipiente em uma incubadora umidificada a 20 °C e ar ambiente.
3. As células geralmente estão prontas para os experimentos dentro de 24 horas, quando a diferenciação morfológica e a expressão dos marcadores GFP estão completas. As células podem ser mantidas em cultura por até 2 semanas, mas geralmente são mais saudáveis até 7-9 dias após o plaqueamento. O meio precisa ser substituído uma vez por dia para manter as células saudáveis.

Resultados

Figura 1. Embriões de C. elegans antes e após o tratamento com quitinase. (A) Fotografia de ovos antes da exposição à quitinase. A seta aponta para a casca de ovo transparente e intacta ao redor de um embrião. (B) Ovos tratados com quitinase por 10 min. As cascas dos ovos foram digeridas e não são mais visíveis ao redor dos embriões. As setas ap...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
REAGENTS
L-15 Medium (1x) Líquido de Leibovitz	Invitrogen	11415-064
Fetal Soro Bovino	Invitrogen	Rolamento 16140-063
Penicilina-estreptomicina	sigma	Pág. 4333-100ML
Quitinase de Streptomyces Griseus	sigma	C6137-25UN
Lectina de amendoim	sigma	L0881-10MG
EQUIPAMENTO
101-1000 μl Pontas de pipeta graduadas azuis	EUA Scentific	Rolamento 1111-2821
10 ml Pipeta Esterilizada Embalada Individualmente	EUA Scentific	1071-0810
Volume variável ergonômico (100-1000 μl) Pipetador com ejetor de ponta	VWR International Inc.	89079-974
Auxiliar de pipeta portátil, Drummond	VWR International Inc.	Rolamento 53498-103
Transfer Plastic Pipet Sterile	VWR International Inc.	14670-114
15 ml Tubo cônico	EUA Scentific	1475-1611
Agulhas estéreis de calibre 18	Becton, Dickinson e Cia.	305196
Seringas estéreis de 10 ml	Becton, Dickinson e Cia.	305482
Filtros de seringa de plástico Corning Tamanho de poro de 0,20 μm	Corning	431224
Filtro de seringa Acrodic de 25 mm com membrana versapor de 5 μm	VWR International Inc.	Rolamento 28144-095
60x15 mm Placa de Petri Estéril	VWR International Inc.	82050-548
100x15 mm Placa de Petri Estéril	VWR International Inc.	82050-912
12 mm de diâmetro lamínulas de vidro	VWR International Inc.	Rolamento 48300-560
Placas de Cultura de Células Transparentes 24 Poços Fundo Plano com tampa	Thomas científico	Nº 6902A09
Dumont #5- Fórceps Fino	Ferramentas de Belas Ciências	11254-20
Centrífuga 5702	Eppendorf	22629883
Capuz de fluxo laminar
Microscópio invertido com objetiva x10
Incubadora umidificada de ar ambiente