$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Este protocolo é um trecho de Tong et al, Eletrotaxia baseada em microfluídica para análise quantitativa sob demanda da locomoção de Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2013).
1. Experimento de eletrotaxia
- Coloque o microcanal no palco (de preferência móvel XY) de um microscópio com uma câmera montada conectada a um monitor (Figura 1).
- Conecte a fonte de alimentação ou ampfios de saída do amplificador aos eletrodos do microcanal. Uma fonte de alimentação CC simples é suficiente se apenas um sinal CC for desejado, mas um amplificador conectado a um gerador de funções também permite a aplicação de sinais CC e CA pulsados.
- Conecte o tubo de saída do microcanal a uma seringa descartável. Mergulhe a boca do tubo de entrada em tampão fisiológico M9 e aspire suavemente o líquido para o canal aplicando uma pressão negativa dentro da seringa (manualmente ou usando uma bomba de seringa). Quando os tubos de entrada e saída estiverem cheios de M9, desconecte a seringa do tubo. Nivele os dois tubos na mesma altura para evitar o fluxo acionado hidrostaticamente.
- Aplique uma tensão CC ao canal e certifique-se de que a resistência (R = V / I) seja em torno de 0.6 MΩ (para um microcanal de 50 mm de comprimento, 0.3 mm de largura e ~ 0.1 mm de profundidade).
- Se estiver satisfeito com a integridade do canal, siga as etapas acima para carregar vermes de uma suspensão diluída no canal.
- Desconecte a seringa e manipule hidrostaticamente o fluxo ajustando a altura relativa dos tubos. Use este método para colocar uma minhoca no centro do canal e, em seguida, coloque os dois tubos na mesma elevação.
- Defina a fonte de alimentação para o volume apropriadotage: 4-12 V/cm para animais do estágio L3, 4-10 V/cm para L4s e 2-4 V/cm para adultos jovens. Ative o sinal elétrico e aguarde 1 min de pré-exposição para que o verme se acostume ao campo. O verme deve começar a se mover em direção ao cátodo. Quando o minuto tiver passado, use a câmera para começar a gravar.
- Para experimentos CA e CC pulsada, o campo elétrico responsivo máximo pode ser adotado de cima e a frequência e o ciclo de trabalho do sinal podem ser modulados conforme desejado.
- Quando o experimento terminar, remova todo o líquido (e vermes) do canal, enxágue-o com dH20 e deixe o dispositivo em uma placa quente a 125 ° C para secar.
- Extraia dados de locomotoria de vídeos gravados manualmente usando o NIH ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/) ou software de rastreamento de worms personalizado baseado em MATLAB.
