Este protocolo é um trecho de Tong et al, <a href="https://www.jove.com/video/50226/microfluidic-based-electrotaxis-for-on-demand-quantitative-analysis">Eletrotaxia baseada em microfluídica para análise quantitativa sob demanda da locomoção de Caenorhabditis elegans</a>, J. Vis. Exp. (2013).
1. Experimento de eletrotaxia
<ol>
	<li>Coloque o microcanal no palco (de preferência móvel XY) de um microscópio com uma câmera montada conectada a um monitor (Figura 1).</li>
	<li>Conecte a fonte de alimentação ou ampfios de saída do amplificador aos eletrodos do microcanal. Uma fonte de alimentação CC simples é suficiente se apenas um sinal CC for desejado, mas um amplificador conectado a um gerador de funções também permite a aplicação de sinais CC e CA pulsados.</li>
	<li>Conecte o tubo de saída do microcanal a uma seringa descartável. Mergulhe a boca do tubo de entrada em tampão fisiológico M9 e aspire suavemente o líquido para o canal aplicando uma pressão negativa dentro da seringa (manualmente ou usando uma bomba de seringa). Quando os tubos de entrada e saída estiverem cheios de M9, desconecte a seringa do tubo. Nivele os dois tubos na mesma altura para evitar o fluxo acionado hidrostaticamente.</li>
	<li>Aplique uma tensão CC ao canal e certifique-se de que a resistência (R = V / I) seja em torno de 0.6 MΩ (para um microcanal de 50 mm de comprimento, 0.3 mm de largura e ~ 0.1 mm de profundidade).</li>
	<li>Se estiver satisfeito com a integridade do canal, siga as etapas acima para carregar vermes de uma suspensão diluída no canal.</li>
	<li>Desconecte a seringa e manipule hidrostaticamente o fluxo ajustando a altura relativa dos tubos. Use este método para colocar uma minhoca no centro do canal e, em seguida, coloque os dois tubos na mesma elevação.</li>
	<li>Defina a fonte de alimentação para o volume apropriadotage: 4-12 V/cm para animais do estágio L3, 4-10 V/cm para L4s e 2-4 V/cm para adultos jovens. Ative o sinal elétrico e aguarde 1 min de pré-exposição para que o verme se acostume ao campo. O verme deve começar a se mover em direção ao cátodo. Quando o minuto tiver passado, use a câmera para começar a gravar.</li>
	<li>Para experimentos CA e CC pulsada, o campo elétrico responsivo máximo pode ser adotado de cima e a frequência e o ciclo de trabalho do sinal podem ser modulados conforme desejado.</li>
	<li>Quando o experimento terminar, remova todo o líquido (e vermes) do canal, enxágue-o com dH20 e deixe o dispositivo em uma placa quente a 125 ° C para secar.</li>
	<li>Extraia dados de locomotoria de vídeos gravados manualmente usando o NIH ImageJ (<a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a>) ou software de rastreamento de worms personalizado baseado em MATLAB.</li>
</ol>

ensaio de eletrotaxia: um método para observar a locomoção em c. elegans

Electrotaxis Assay: A Method to Observe Locomotion in C. elegans

Fonte: Tong, J, et al. <a href="https://www.jove.com/video/50226/microfluidic-based-electrotaxis-for-on-demand-quantitative-analysis">Eletrotaxia baseada em microfluídica para análise quantitativa sob demanda da locomoção de Caenorhabditis elegans.</a>J. Vis. Exp.(2013).
Os pesquisadores podem desencadear o movimento sob demanda em C. elegans aplicando um campo elétrico que os vermes detectam e respondem. Este vídeo apresenta o comportamento eletrotático e mostra um protocolo de amostra que é feito em um dispositivo microfluídico.

<img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/20162/20162fig1.jpg"> 
Figura 1. Esquema da plataforma de triagem microfluídica para ensaio de eletrotaxia de nematóides.

Ensaio de eletrotaxia: um método para observar a locomoção em C. elegans

Fonte: Tong, J, et al. Eletrotaxia baseada em microfluídica para análise quantitativa sob demanda da locomoção de Caenorhabditis elegans.

- Sem estímulos sensoriais, o movimento de C. elegans é geralmente para frente e é interrompido por reversões e curvas - manobras aleatórias de reorientação que resultam em uma mudança de direção. C. elegans são eletrorreceptores. Ou seja, eles podem sentir campos elétricos. Quando expostos a uma corrente contínua suave ou CC, os vermes se movem em um caminho reto e ininterrupto na direção do eletrodo negativo ou cátodo, um comportamento denominado eletrotaxia. Para observar com mais precisão a locomoção do verme, coloque o animal em um dispositivo microfluídico e aplique um campo elétrico DC. Inverta a direção do campo e o verme virará para o lado oposto - na direção do cátodo. Aplique uma corrente alternada, AC, e o worm irá parar. A mudança alternada na direção do campo sobrecarrega os sistemas neuromotores do verme, resultando na imobilização do verme. Reaplique o campo DC e o worm retomará o movimento para frente em direção ao cátodo. No protocolo de exemplo a seguir, veremos uma configuração demonstrando um ensaio de eletrotaxia em um dispositivo microfluídico. - Comece esta etapa colocando o microcanal recém-montado em um estágio móvel xy- de um microscópio com uma câmera montada conectada a um monitor. Conecte a fonte de alimentação aos eletrodos do microcanal. Depois de confirmar que a resistência do microcanal é de cerca de 0,6 mega-ohms, conecte o tubo de saída do microcanal a uma seringa descartável. Em seguida, mergulhe a boca do tubo de entrada em uma solução de nematóides suspensa em tampão fisiológico M9. Aplique pressão negativa dentro da seringa para aspirar o líquido para o canal. Quando os tubos de entrada e saída estiverem cheios, desconecte a seringa e manipule hidrostaticamente o fluxo ajustando a altura relativa do tubo para colocar um sem-fim no centro do canal. Em seguida, coloque os dois tubos na mesma elevação. Para manter o fluxo zero dentro do microcanal ao trocar amostras de vermes durante um experimento de eletrotaxia, depois de nivelar ambos os tubos de entrada para a mesma elevação, se ainda houver fluxo, faça pequenos ajustes na altura do tubo em relação um ao outro. - Se não tivermos certeza se o fluxo é realmente zero, podemos induzir uma reversão no movimento do verme alterando a polaridade do campo elétrico e, em seguida, avaliando a velocidade linear do verme à medida que ele gira. - Agora, defina a fonte de alimentação para a voltagem apropriada. Ative o sinal elétrico e aguarde um minuto de pré-exposição para que o verme se acostume ao campo, durante o qual o verme deve começar a se mover em direção ao cátodo. Quando o minuto tiver passado, comece a gravar. Quando o experimento terminar, remova todo o líquido e vermes do canal. Enxágue a câmara com água desionizada e deixe o dispositivo em uma placa quente a 125 graus Celsius para secar.

electrotaxis-assay-a-method-to-observe-locomotion-in-c-elegans

Research

JoVE Encyclopedia of Experiments

Biology

Biologia

Caenorhabditis elegans (worm)

Caenorhabditis elegans (verme)

Behavior

Comportamento

2.1K visualizações. - Sem estímulos sensoriais, o movimento de C. elegans é geralmente para frente e é interrompido por reversões e curvas - manobras aleatórias de reorientação que resultam em uma mudança de direção. C. elegans são eletrorreceptores. Ou seja, eles podem sentir campos elétricos. Quando expostos a uma corrente contínua suave ou CC, os vermes se movem em um caminho reto e ininterrupto na direção do eletrodo negativo ou cátodo, um comportamento denominado ...

Ensaio de eletrotaxia: um método para observar a locomoção em C. elegans

Abstract

Protocol

<img title="figure-results-1" alt="figure-results-1" src="/files/ftp_upload/20162/20162fig1.jpg"> 
Figura 1. Esquema da plataforma de triagem microfluídica para ensaio de eletrotaxia de nematóides.

Ensaio de eletrotaxia: um método para observar a locomoção em C. elegans

Neste artigo

Resumo

Protocolo

Resultados

Etiquetas