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O protocolo a seguir é um trecho de Davies et al, Um ensaio para medir os efeitos do etanol na velocidade de locomoção de Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2015).
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Passos a Realizar no Dia Anterior ao Ensaio
- Escolher vermes de estádio L4 em placas frescas de meio de crescimento de nemátodes (NGM) semeadas com um relvado de OP50 E. coli e cultivá-las a 20 °C O/N. Cada condição de ensaio requer 10 vermes; escolha um excesso de minhocas para permitir a perda de minhocas O/N.
- Apenas animais de ensaio que são adultos no primeiro dia; muitos mutantes crescem a uma velocidade mais lenta do que o tipo selvagem. Ajustar o momento da colheita das estirpes que apresentam atrasos no desenvolvimento, de modo a que todos os animais testados sejam adultos no primeiro dia.
- Etapas a serem executadas no dia do ensaio
- Preparação para o ensaio:
- Realizar ensaios em placas NGM padrão de 60 x 15 mm não semeadas. Seque todas as placas a serem usadas a 37 °C por 2 horas, sem as tampas. Para cada ensaio experimental, utilizar quatro placas NGM secas; estas serão as placas de ensaio de etanol 0 mM e 400 mM e suas placas de aclimatação que as acompanham.
OBSERVAÇÃO: O uso de placas NGM é importante aqui; Diferenças na composição das placas, em particular sua osmolaridade, podem afetar fortemente a resposta à dose de etanol no comportamento, isso se deve, pelo menos em parte, a mudanças na quantidade de etanol acumulada pelos animais. O ágar NGM é de 160 mOsm.
- Após a secagem, pesar cada uma das placas NGM não semeadas a utilizar no ensaio e anotar o peso. Determine o volume de mídia nas chapas com base no peso de uma chapa vazia. Para aproximar a conversão do peso do ágar em volume, suponha que o meio pese o mesmo que um volume igual de água.
OBSERVAÇÃO: Nossos resultados mais consistentes foram encontrados com meios NGM que desidrataram o suficiente para que um volume original de 10 ml tenha um volume pós-secagem entre 8,3 e 8,9 ml. Uma alternativa ao tempo de secagem de 2 horas é secar até que as placas atinjam essa faixa de volume para levar em conta as diferenças nas incubadoras.
- Derreta 4 anéis de cobre (diâmetro interno de 1,6 cm) na superfície de cada uma das placas para atuar como currais para os diferentes genótipos ou grupos de tratamento de vermes. Segure cada anel com uma pinça e aqueça em uma chama (uma chama forte de um bico de Bunsen funciona bem) por aproximadamente 3 segundos. Coloque imediatamente o anel em um prato enquanto ainda segura o anel com a pinça para evitar que ele 'pule'.
- Certifique-se de que o anel esteja apoiado na superfície do ágar pressionando suavemente com a pinça em vários pontos do anel. Ao colocar o anel, tome cuidado para deixar espaço para mais três anéis.
- Derreta os três anéis de cobre adicionais na superfície da placa, tomando cuidado para colocá-los o mais próximo possível para que todos os quatro fiquem no campo de visão da câmera.
OBSERVAÇÃO: Fazer uma boa vedação com o ágar é essencial para manter os vermes nos anéis durante o ensaio. É improvável que os anéis que saltam na placa façam a vedação correta com o ágar e podem deixar cicatrizes no ágar, o que permite que os vermes se enterrem e interfira na visualização dos vermes.
- Para cada placa de ensaio, prepare uma placa de "aclimatação" que deve ser seca e sem sementes e não receberá etanol. Coloque quatro anéis de cobre nessas placas.
- Rotule a parte inferior das placas ao lado de cada anel com a cepa de verme a ser usada no anel, tomando cuidado para não escrever no campo de visão do próprio anel. Combine os rótulos da placa de ensaio com a placa de aclimatação que a acompanha.
- Calcule a quantidade de etanol a 100% a ser adicionada a cada placa de ensaio de modo que a concentração final seja 0 mM ou 400 mM de etanol (peso em relação ao volume). Para cada experimento (n = 1), haverá uma placa de etanol 0 mM e uma placa de etanol 400 mM; As placas de aclimatação não recebem etanol. Adicione o etanol, pipetando-o ao redor da superfície da placa. Use filme de laboratório para selar a placa e deixá-la equilibrada na bancada por 2 horas.
- Quando 1.5 hora tiver decorrido, inicie a etapa de aclimatação do ensaio, etapa 2.2.
- Realizar ensaio de locomoção: Placas de ensaio
- Transfira cuidadosamente 10 vermes de cada grupo experimental para o centro de um anel de cobre na placa de aclimatação. Remova qualquer alimento que esteja visível no ágar neste momento, raspando suavemente com o picador de minhoca. Varie a ordem em que os grupos experimentais são colocados nas placas entre os ensaios experimentais para que as mesmas cepas não sejam colocadas nas placas na mesma ordem entre os ensaios.
OBSERVAÇÃO: O objetivo é transferir os animais para o prato com quantidades mínimas de alimento, pois se o alimento na placa de aclimatação for transferido para a placa de ensaio, os vermes se agregarão ao redor do alimento e o efeito da droga na locomoção será obscurecido.
- Tenha cuidado para não quebrar a superfície do ágar com a picareta, pois isso permitirá que os vermes se enterrem e interrompam o ensaio. Incube os vermes em RT por 30 min.
- Certifique-se de que haja um intervalo apropriado entre as iniciações de cada placa. Um experimentador experiente pode mover 40 animais, 10 / anel para 4 anéis em < 1,5 min, mas qualquer intervalo de até 2 min é aceitável. O ensaio padrão tem gravação de filmes em 10-12 min e 30-32 min de exposição para etanol 0 mM e 400 mM.
- Inicie a placa de aclimatação para a exposição de 0 mM e a placa de aclimatação para a exposição de 400 mM com uma distância de aproximadamente 2 minutos e 30 segundos para permitir a gravação do primeiro ficheiro de filme antes de começar o segundo filme.
- Após o período de aclimatação de 30 minutos, transfira os vermes das placas de aclimatação para as placas de ensaio. Transferir as minhocas para as placas de ensaio (etanol 0 mM ou 400 mM) na mesma ordem em que foram adicionadas à placa de aclimatação, acompanhando o tempo entre as completações de cada placa. Sele a placa com filme de laboratório para minimizar a perda de etanol por vaporização.
- Use um movimento de escavação com uma picareta de minhoca achatada de borda fina para coletar minhocas em cima da picareta achatada. Realize a transferência de vermes da placa de aclimatação não semeada para a placa de ensaio sem o uso de bactérias, que é comumente usada na transferência de vermes, pois ajuda a colar o verme na picareta.
OBSERVAÇÃO: A velocidade com que os animais são transferidos nesta etapa é muito importante porque os primeiros vermes na placa serão expostos ao etanol por mais tempo do que os últimos vermes adicionados à placa, e pontos de tempo anteriores podem mostrar alguns efeitos dependentes do tempo. Esta é a principal razão para a rotação de quais cepas são colocadas em uma placa primeiro entre as réplicas experimentais.
- Realizar Ensaio de Locomoção: Filmagem
- Use uma combinação de microscópio/câmera que permita a aquisição simultânea de imagens simultâneas de todos os quatro anéis no campo de visão (aproximadamente 42x42 mm2 quadrados), como uma objetiva de microscópio de 0,5x, ampliação de 0,8x e uma câmera com um CCD de pixel de 2048x2048 7,4 μm.
- Use iluminação uniforme em todo o campo de visão, o que ajuda no reconhecimento de objetos na etapa do limite de intensidade. Uma luz de fundo de 3 "x3" funciona bem.
- Visualize os vermes em uma placa posicionada com o lado da mídia para cima (tampa para baixo), o que gera contraste que é perdido ao usar a luz de fundo em comparação com uma fonte de luz transmitida por microscópio tradicional.
- Prepare o software de análise de imagem para capturar filmes com lapso de tempo dos vermes em movimento. Configure o software para capturar imagens em escala de cinza de 12 bits a cada 1 segundo, como um filme de 2 minutos (120 quadros). Para reduzir o tamanho do arquivo de saída, mantendo a resolução de imagem suficiente, use um modo de compartimentalização 2x2 para capturar imagens de 1024x1024 pixels.
- Grave os filmes. Comece a gravar um filme de 120 quadros da primeira placa (etanol 0 mM) 10 minutos depois que os últimos vermes foram colocados nessa placa. Salve o arquivo de filme.
- Registar a segunda placa (400 mM de etanol). Repita esse processo para ambas as placas começando 30 min após os últimos vermes terem sido colocados na primeira placa (etanol 0 mM) para capturar os pontos de tempo de 30 a 32 min para cada exposição.
OBSERVAÇÃO: Reserve tempo suficiente para salvar os arquivos de imagem após cada sessão de captura antes de iniciar a gravação da próxima placa a ser analisada.
- Para preparar filmes arquivados para o futuro e permitir que esses filmes sejam abertos e analisados por outros programas de software de imagem de código aberto de domínio público, como o ImageJ, converta uma cópia de cada filme em arquivos TIFF de 8 bits em escala de cinza de 256 bits.
OBSERVAÇÃO: O software de análise de imagem descrito aqui usa um formato de arquivo proprietário.