Preparação do Tecido Cerebral de Rato imunomicroscopia

Resumo

Nós descrevemos um protocolo para perfusão intracardíaca de ratos, remoção e corte do cérebro, bem como coloração por imunoperoxidase, a incorporação de resina, seccionamento e ultrafina das seções do cérebro. Após a conclusão desses procedimentos, o material imunocoradas está pronto para exame em microscopia eletrônica de transmissão.

Resumo

Microscopia eletrônica de transmissão (TEM) é extremamente útil para visualizar microglial, oligodendrocytic, astrocíticos e neuronal compartimentos subcelulares (dendrito, espinha dendrítica, axônio, axônio terminal, pericário), bem como suas organelas e do citoesqueleto intracelular no sistema nervoso central em alta resolução espacial. Combinado com o TEM, pré-incorporação imunocitoquímica permite a discriminação de elementos celulares com poucas características e critérios de identificação (por exemplo, microglial perikarya e processos, quando se utiliza um anticorpo contra o marcador microglia específicos Iba1 (cálcio ionizado molécula adaptador de ligação 1; como apresentado aqui)), identificando o conteúdo do neurotransmissor dos elementos celulares (por exemplo, serotoninérgicos) e sua localização ultra-estrutural de proteínas solúveis ou ligada à membrana (por exemplo, 5 HT1A e EphA4 receptores). Aqui, nós descrevemos um protocolo para perfusão intracardíaca de camundongos com acroleína fixador, remoção e corte do cérebro, bem como imunoperoxidase diaminobenzidina-coloração (DAB), a incorporação de resina, seccionamento e ultrafina das seções do cérebro. Após a conclusão desses procedimentos, o material imunocoradas está pronto para exame com TEM. Quando rigorosamente realizada, esta técnica fornece um excelente compromisso entre a preservação ultraestrutural e detecção imunocitoquímica ideal.

Protocolo

1. Perfusão animais

1. No dia antes da perfusão, prepare:
   - 2 L de tampão fosfato (PB; 100 mM, pH 7,4) e 1 L de sódio tampão fosfato (PBS, 0,9% NaCl em 50 mM PB, pH 7,4) em água destilada duas vezes. Armazenar o PBS e 1L de PB a 4 ° C. Estes serão usados ​​para a perfusão e incorporação de pré-imunocitoquímica.
   - Solução de 1L de paraformaldeído 4,0% (PFA, pH 7,4) fixador, o que permitirá a perfusão de 6 camundongos. Para o efeito, aquecer 1 L de PB sob uma coifa. Pesar 40 g de paraformaldeído granular (PFA) e despeje na solução PB quando atinge 60 ° C. Quando a solução é clara, com o PFA completamente dissolvido, arrefecer à temperatura ambiente (R....

Discussão

Aqui nós descrevemos um protocolo para a preparação do tecido cerebral do rato para imunomicroscopia que oferece um excelente compromisso entre a preservação ultraestrutural e detecção imunocitoquímica ideal, quando os procedimentos são rigorosamente executado.

Combinado com o TEM, este método permite distinguir elementos celulares com poucas características e critérios de identificação. Em particular, a coloração de imunoperoxidase DAB-de Iba1 permite identificar perikarya microglial e proc.......

Materiais

* Deve-se sempre trabalhar sob um exaustor e usar luvas ao manusear nitrilo acroleína, paraformaldeído, e ósmio e também deve dispor de seus resíduos de forma adequada.