Preparação de amostras para metabolômica: um método para preparar amostras de células para perfil de metabólitos

Abstract

Fonte: Zhao, Y. C. et. al., Biologia de Sistemas da Regulação Metabólica pela Sinalização do Receptor de Estrogênio no Câncer de Mama. J. Vis. Exp. (2016).

Este vídeo descreve uma técnica de preparação de amostras de células de câncer de mama para perfil de metabólitos. As células do câncer de mama são tratadas com estradiol, que se liga ao receptor de estrogênio alfa e causa alteração na composição do metabólito.

Protocol

1. Ensaio Metabolômico Preparação de Amostra

1. Cultura e Tratamento de Células
   1. Semear 400.000 células MCF7 por placa de 10 cm em meio de crescimento. Para cada tratamento, prepare três amostras. Use duas placas em cada amostra para receber células suficientes para a detecção. No dia 3, remova o meio e adicione 5 ml de meio fresco com ou sem ^10-8 M Estradiol ou E2 às células. Trate as células por 24 horas (37 ° C em atmosfera umidificada de CO_{5 2}).
2. Coleta de amostras
   1. Adicione 5 ml de PBS 1x gelado à placa, aspire o PBS depois de inclinar brevemente a placa várias vezes. Repita duas vezes e remova o máximo de PBS possível após a última lavagem.
   2. Adicione 750 μl de acetona pré-fria a cada placa e raspe as células. Combine as células em acetona de duas placas em um tubo de 2 ml sobre gelo.
   3. Contagem de células para normalização
      1. Para cada tratamento, use duas placas extras para quantificação celular. Para desconectar as células da placa, adicione 2 ml de tampão HE (1x HBSS, 10 mM HEPES, 0,075% NaHCO₃ e 1 mM EDTA) em cada placa e incube por 5 min.
      2. Colete e misture bem as células pipetando as células no tampão HE. Utilizar um total de 20 μl de solução celular para contar o número de células utilizando um hemocitómetro.
3. Armazene as amostras a -80 °C antes de enviá-las ao centro de metabolômica para identificar e quantificar os metabólitos usando análise de espectrometria de massa por cromatografia gasosa (GC-MS).