O sapo Xenopus laevis Oferece um atraente modelo de não-mamíferos alternativa para explorar a capacidade da proteína de choque térmico, tais como para promover a gp96 antígeno-específica de células T CD8 respostas. Nós apresentamos métodos para o estudo In vivo Facilitação de apresentação cruzada de antígenos de tumor de pele e gp96.
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Artigo de método
Comparativo In vivo Estudo da gp96 adjuvante no Sapo Xenopus laevis
Neste artigo
Resumo
Resumo
Temos desenvolvido no Xenopus laevis anfíbios um modelo não-mamíferos única de estudar a capacidade das proteínas de choque térmico certos (HSPs) como gp96 para facilitar a apresentação cruzada de antígenos chaperoned e provocar inata e adaptativa respostas de células T. Xenopus rejeição do enxerto de pele fornece uma excelente plataforma para estudar a capacidade de gp96 para provocar clássicos MHC de classe Ia (classe IA) restringiu as respostas das células T. Além disso, o sistema modelo de Xenopus também oferece uma alternativa atraente aos ratos para explorar a capacidade de gerar respostas gp96 contra tumores que têm baixo-regulado suas moléculas de classe Ia escapando desta forma de vigilância imunológica. Recentemente, desenvolvemos um ensaio transferência adotiva de células em Xenopus clones usando leucócitos peritoneal como células apresentadoras de antígenos (APCs), e mostrou que pode gp96 prime T CD8 respostas de células in vivo contra antígenos de histocompatibilidade menores da pele, bem como contra o tumor do timo Xenopus 15 / 0 que não expressam moléculas Ia classe. Descrevemos aqui a metodologia envolvida para realizar essas análises, incluindo a transferência de elicitação pulsante, e adotivos de leucócitos peritoneal, bem como o enxerto de pele e ensaios transplante tumor. Além disso também estamos descrevendo a colheita e separação de leucócitos do sangue periférico utilizado para a citometria de fluxo e ensaios de proliferação que permitem uma melhor caracterização das populações efetoras envolvidas na rejeição da pele e anti-tumor respostas.
Protocolo
1. Animais
X. laevis x X. Gilli híbridos LG-6 e LG-15 isogenetic clones 1 são da nossa colônia de reprodução da Universidade de Rochester (http://www.urmc.rochester.edu/smd/mbi/xenopus/index.htm). LG-6 e LG-15 compartilham o mesmo haplótipo heterozigoto MHC (a / c), mas diferem em menores de histocompatibilidade (H) loci. Progênie desses clones são produzidos por gynogenesis, em que os ovos diplóides produzido pela fêmea são ativados por UV-irradiados esperma (não há contribuição de DNA para os descendentes).
O uso de luvas é facultativa. Algumas pessoas preferem não usá-los porque é....
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Discussão
O anfíbio Xenopus é um exclusivo modelo de não-mamíferos versátil para estudar a imunidade. Sua ampla utilização na pesquisa biomédica e imunológicos rendeu em muitas ferramentas de pesquisa importantes, como os clones MHC definido LG-6 e LG-15, bem como linhas de células diferentes e anticorpos monoclonais. Usando essas ferramentas nós estabelecemos diferentes in vitro e em ensaios in vivo para estudar a capacidade das proteínas de choque térmico, como gp96 para mediar potente Ag-esp.......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
A criação de animais técnicos fornecidos pela Tina Martin e David Albright é apreciadas. Esta pesquisa foi suportada por concessões T32-AI-07285 (HN), NIH R25 2GM064133 (TCL), 1R03-HD061671-01, R24-AI-059830-06 do NIH.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Reagentes necessários: | |||
| Salina Tamponada com Fosfato para Anfíbios (APBS): | |||
| NaCl, 1,15 g/L | |||
| Na2HPO4, 0,2 g/L | |||
| KH2PO | |||
| NaOH 10 N | |||
| Tricaina Metano Sulfonato (TMS, MS-222) | Crescent Research Chemicals | CAS#886-86-2 | |
| Bicarbonato de sódio | Fisher Scientific | S-233-500 | |
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | 100 ml |
| Sal de Sódio da Heparina | Sigma-Aldrich | H3149-50KU | |
| Meio de cultura para tumores Xenopus 15/0 [ver 3 para mais detalhes]: | |||
| Meio basal Iscove DMEM | GIBCO, da Life Technologies | 11965 | |
| Insulina | |||
| Aminoácidos não essenciais | |||
| Penicilina-estreptomicina | |||
| Kanamicina | |||
| Primatone | Divisão de Produtos Sheffield | ||
| β2-mercaptoetanol–etanol | |||
| NaHCO₃ | |||
| 30% água destilada duplamente | |||
| 5% soro bovino fetal | |||
| 20% do sobrenadante de uma linhagem celular de rim de Xenopus, A6 | |||
| 0,25% de soro normal de Xenopus | |||
| Materiais e Equipamentos: | |||
| Tubos cónicos estéreis de centrífuga de 50 e 15 ml | |||
| agulhas estéreis Precision Glide de 25 mm de diâmetro e 5/8 de polegada | BD Biosciences | ||
| 18 gauge 1½ Aguilhas estéreis Precision Glide | BD Biosciences | ||
| Seringa estéril de 1 ml com ponta lisa para tuberculina | BD Biosciences | ||
| Seringa estéril com ponta de encaixe de 10 ml | BD Biosciences | ||
| Tubos de microcentrífuga de 1,5 ml (esterilizados) | |||
| Placas de Petri de poliestireno estéreis, 60 x 15 mm | Falcon BD | ||
| Lâminas de barbear | |||
| Lâminas de microscópio premium 25 x 75 mm x 1 mm | Fisher Scientific | ||
| placas de Petri de vidro de 10 cm | |||
| 9" Pipetas Pasteur Descartáveis de Vidro Borossilicato Durex com Tampão de Algodão | VWR international | ||
| Tubulação Tygon | |||
| Dois joalheiros suíços nº 5’s Pinça | Miltex Inc. | ||
| Tesoura cirúrgica microdissecante McPherson-Vannas com borda reta de corte de 6 mm | Roboz Surgical Instruments Co. | ||
| paquímetros Helios | |||
| Microscópio de dissecação | |||
| Iluminador de alta intensidade | |||
| Hemocitômetro | |||
| Desligar o bico de Bunsen | |||
| 37°incubadora com agitação | |||
| Centrifugação |
Referências
- Kobel, H. R., Pasquier, D. u, L, Hyperdiploid species hybrids for gene mapping in Xenopus. Nature. 279, 157-158 (1979).
- Robert, J., Menoret, A., Basu, S., Cohen, N., Srivastava, P. R. Phylogenetic conservation of the molecular and immunological properties of the....
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Reimpressões e permissões
