Comparativo In vivo Estudo da gp96 adjuvante no Sapo Xenopus laevis</em

Resumo

O sapo Xenopus laevis Oferece um atraente modelo de não-mamíferos alternativa para explorar a capacidade da proteína de choque térmico, tais como para promover a gp96 antígeno-específica de células T CD8 respostas. Nós apresentamos métodos para o estudo In vivo Facilitação de apresentação cruzada de antígenos de tumor de pele e gp96.

Resumo

Temos desenvolvido no Xenopus laevis anfíbios um modelo não-mamíferos única de estudar a capacidade das proteínas de choque térmico certos (HSPs) como gp96 para facilitar a apresentação cruzada de antígenos chaperoned e provocar inata e adaptativa respostas de células T. Xenopus rejeição do enxerto de pele fornece uma excelente plataforma para estudar a capacidade de gp96 para provocar clássicos MHC de classe Ia (classe IA) restringiu as respostas das células T. Além disso, o sistema modelo de Xenopus também oferece uma alternativa atraente aos ratos para explorar a capacidade de gerar respostas gp96 contra tumores que têm baixo-regulado suas moléculas de classe Ia escapando desta forma de vigilância imunológica. Recentemente, desenvolvemos um ensaio transferência adotiva de células em Xenopus clones usando leucócitos peritoneal como células apresentadoras de antígenos (APCs), e mostrou que pode gp96 prime T CD8 respostas de células in vivo contra antígenos de histocompatibilidade menores da pele, bem como contra o tumor do timo Xenopus 15 / 0 que não expressam moléculas Ia classe. Descrevemos aqui a metodologia envolvida para realizar essas análises, incluindo a transferência de elicitação pulsante, e adotivos de leucócitos peritoneal, bem como o enxerto de pele e ensaios transplante tumor. Além disso também estamos descrevendo a colheita e separação de leucócitos do sangue periférico utilizado para a citometria de fluxo e ensaios de proliferação que permitem uma melhor caracterização das populações efetoras envolvidas na rejeição da pele e anti-tumor respostas.

Protocolo

1. Animais

X. laevis x X. Gilli híbridos LG-6 e LG-15 isogenetic clones ¹ são da nossa colônia de reprodução da Universidade de Rochester (http://www.urmc.rochester.edu/smd/mbi/xenopus/index.htm). LG-6 e LG-15 compartilham o mesmo haplótipo heterozigoto MHC (a / c), mas diferem em menores de histocompatibilidade (H) loci. Progênie desses clones são produzidos por gynogenesis, em que os ovos diplóides produzido pela fêmea são ativados por UV-irradiados esperma (não há contribuição de DNA para os descendentes).

O uso de luvas é facultativa. Algumas pessoas preferem não usá-los porque é mais difícil lidar com as rãs (escorregadio) e de fato parece fazer as rãs desconfortável.

2. Purificação da gp96 de 15 / 0 Tumor (expressa tanto Tumor e Menores H-Ags)

Gp96 purificação foi descrito anteriormente ^{2, 3.} Resumidamente, gp96 é purificada por fracionamento 50-70% sulfato de amônio, seguido de ConA-Sepharose e cromatografia DEAE. Cerca de 20-50 mg de proteína pode ser obtida por 1 mL de tecido do tumor. Pureza da preparação é determinado por SDS-PAGE e coloração lasca.

3. Elicitação e Colheita de Leucócitos Peritoneal (PLs) de Minor H-Ag-díspares LG-6 Frogs

1. Crescer uma noite para o dia 25 mL E. Cultura coli em um tubo de 50 ml a 37 ° C com agitação.
2. O calor dia seguinte matar as bactérias pela fervura por 1 hora.
3. Centrifugar o calor matou E. Coli por 15 min a 2.000 rpm (1.500 g) a 4 ° C.
4. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento de bactérias em 1 / 10 ^º volume da cultura original (2,5 mL) em APBS. Neste ponto, a cultura bacteriana está pronto para uso e deve ser usado dentro de 24 horas.
5. Injetar por via intraperitoneal (ip) 200 (para um sapo 2 polegada) ou 300 mL (para um sapo de 3 polegadas) da preparação de calor matou bacteriana por sapo usando um calibre 25 08/05 agulha.
6. Três dias após a injeção PLs são colhidas por lavagem intraperitoneal.
7. Antes da colheita PL, sapos adultos são anestesiados por imersão em uma solução aquosa de 0,1% tricaina sulfonato metano (TMS, MS-222) tamponada com bicarbonato de sódio para até 5 min até que todo o movimento cessa (duração depende do tamanho e idade). Animais acordar dentro de 10-20 min após o tratamento.
8. Desinfectar o abdômen do sapo com uma pequena quantidade de etanol a 70%.
9. Injetar 5 mL (para um sapo 2 polegadas) ou 10 mL (para um sapo de 3 polegadas) de APBS estéril pré-aquecido em temperatura ambiente para a cavidade peritoneal através de um calibre 18 1 ½ agulha. Remova a agulha e massagear suavemente o sapo por um minuto para assegurar que o buffer injetado equilibra com o líquido na cavidade do corpo.
10. Use um medidor de 18 novos 1 ½ agulha sem uma seringa para coletar o líquido peritoneal que vai pingar na parte de trás da agulha em um tubo limpo de 50 mL cônico. Certifique-se de recuperar o máximo de volume inicial injetado possível. Ter cuidado para evitar os vasos sanguíneos na área central da região abdominal.
11. Uma vez que PLs são colhidas colocar o sapo em um recipiente com água rasa até que seja acordado em que ponto ele pode ser colocado de volta em sua gaiola.

4. Transferência pulsante e adotiva do Lg-6 Pls Em Naive Lg-6 Destinatários

1. Lavar os PLs uma vez com APBS frio e centrifugar-los a 1.000 rpm (750 g) por 10 min a 4 ° C.
2. Remover o sobrenadante e ressuspender o PLs em APBS.
3. O pulso do PL com gp96 em uma concentração de 1 mg gp96 por 5 x 10 ⁵ PLs.
4. Uma vez que a quantidade adequada de gp96 é adicionado ao PLS, misturá-los por pipetagem e incubar no gelo por 1 hora.
5. Centrifugar as células ou a 1.000 rpm por 10 min a 4 ° C ou menos 14.000 rpm por 1 min para remover qualquer unbound gp96.
6. Lavar os PLs 3X com APBS fria para garantir que não haja deixado gp96 residual.
7. Ressuspender o PLs pulsado a uma concentração de 5 x 10 ⁵ PLs por 300 mL.
8. Adotivamente transferência PLs por injeção ip usando calibre 25 08/05 agulha. Injetar 300 mL de PLs pulsado (5 x 10 ⁵ células) por animal.
9. Rãs precisam ser preparadas pelo menos três dias antes de continuar com enxerto de pele ou experiências desafio tumor.

5. Ensaio de enxerto de pele

Rejeição do enxerto de pele é um ensaio bem estabelecido em Xenopus ^{4, 5, 6.} Em Xenopus, um destinatário rejeita a pele do doador exibir 1 ou 2 desencontros haplotipo MHC dentro de 18-22 dias a 21-22 ° C. Em contraste, enxertos de pele entre a LG ea LG-6-15 clones que diferem apenas por menores H-Ags são rejeitados mais lentamente (mais que 30 dias). No entanto, essa rejeição é acelerado em receptores that foram imunizadas contra doadores menores H-Ags quer por um enxerto de pele anterior ou pela imunização com gp96 purificada do doador. Sem rejeição em todos ocorre quando o dador eo receptor são geneticamente idênticos (por exemplo, animais clonados ou totalmente puras). Portanto, esta técnica simples é muito poderosa para a caracterização in vivo respostas imunes induzidas pela gp96.

1. Anestesiar sapo doador, conforme descrito em 3.7.
   Nota: Apenas as precauções mínimas precisam ser tomadas desde Xenopus produzir potente anti-microbial peptídeos (por exemplo, magainin) na pele que elimina a necessidade para o total de procedimentos assépticos. Na verdade, o tratamento do sapo com qualquer desinfetante seria prejudicial para a pele. Além disso, Xenopus não têm qualquer patógenos que podem ser transferidos para os seres humanos. Portanto, o uso de luvas é opcional. No entanto, todos os instrumentos usados ​​dissecção precisa ser autoclavados e todas as soluções precisam ser esterilizados.
2. Corte e retire uma pequena (20 mm X 5 mm) pedaço de pele ventral (pele abdominal que aparece prateado, devido à presença de irridophore células pigmentadas) de um sapo doador LG-15 com uma tesoura.
3. Coloque a pele em uma APBS petridish contendo e mantê-lo no gelo. Manipular o tecido da pele muito gentilmente, evite segurá-lo entre fórceps.
4. Usando uma navalha ou tesoura corte enxertos individuais em 5 mm X 5 peças mm. Manter os fragmentos em APBS no gelo.
5. Neste ponto, o sapo doador é colocado em um recipiente com água rasa até que seja acordado e, em seguida, ele é colocado em água contendo antibióticos (Penstrep na concentração de 5 mg / L). O sapo é mantido em água com antibióticos durante dois dias em que ponto ele é devolvido em água normal. A pequena ferida no local onde a pele foi removida não precisa ser costurada e cura em uma semana.
6. Anestesiar o destinatário sapo LG-6.
7. Fazer uma pequena incisão na pele (costas) dorsal do destinatário e insira os 5 mm X 5 mm de enxerto sob a pele com o lado prateado para cima. Tenha cuidado para não introduzir grandes bolhas de ar sob a pele, porque isso pode levar ao deslocamento ou mesmo perda do enxerto.
8. Certifique-se de observar as marcações tesoura e uma pinça na enxertos porque aqueles não são contados como rejeição do enxerto, uma vez o placar começa.
9. 24 horas mais tarde uma parte da pele do hospedeiro sobrepondo precisa ser removido do enxerto.
10. Anestesiar o destinatário sapo LG-6. Lidar com o animal, como descrito em 5.1.
11. Com uma tesoura esterilizada cortar uma janela ao redor do enxerto, para que o enxerto pode ser livremente visualizado. Tenha cuidado para não tocar a pele do doador ou para induzir o sangramento. Vamos recuperar o sapo como descrito em 5.5.
12. Começar a marcar o enxerto de imediato, tomando um esboço. Rejeição do enxerto de pele é determinada pela porcentagem de destruição da irridophores na pele enxertada.
13. Os enxertos precisam ser verificados a cada 2-3 dias, mas os animais não precisam de ser anestesiado para isso. Para visualizar os enxertos, os sapos precisam ser colocados em um petridish sob um microscópio de dissecação.

6. Toda montagem de imuno-histologia pele transplantada

Sapo todo-mount imuno-histologia foi descrita anteriormente ^6. Resumidamente, o sapo é anestesiado e colocado sob o microscópio em uma toalha de papel estéreis pré-molhada com água sapo (a área de trabalho também é preparado em condições assépticas). A pele transplantada é então retirada junto com uma pequena quantidade de pele circundante do host e é corado com anticorpos semelhante à coloração de células para análise de citometria de fluxo ^6. Instrumentos autoclavados e buffers estéreis devem ser usados. Após a coloração da pele é colocada sobre uma lâmina de microscópio e delicadamente pressionado com uma lamínula. Neste ponto, a pele pode ser visualizado utilizando um microscópio de fluorescência para diferentes populações de células que se infiltraram o enxerto. Após o procedimento o sapo é mantido em água com antibióticos, como descrito na seção 5.5. e voltou em água normal. A pequena ferida esquerda, onde a pele foi removida cicatriza em uma semana.

7. Caracterização de leucócitos do sangue

1. Antes de remover o sangue do sapo, é preciso preparar "agulhas de vidro" puxando pipetas Pasteur estéreis sobre chama. A extremidade fina da pipeta está afiada sob o estereomicroscópio. A pipeta é então ligado a um tubo de plástico aspiração.
   Todos os instrumentos, como a pinça e tesouras precisa ser autoclavados antes do uso.
2. Também preparar 10 mL de gelo frio do APBS e solução de heparina pela adição de 50 unidades de heparina por 1 mL de APBS. Mantenha a solução em gelo. Todas as soluções utilizadas devem ser estéreis.
3. Anestesiar sapo como descrito em 3.7, e seguir os procedimentos mesmo animal manuseio, como descrito em 5.1. .
4. Cortar a pele acima do pé posterior para expora veia dorsal do tarso.
5. Encher a pipeta Pasteur com 1-2 mL de solução APBS + heparina.
6. Insira o "agulha de vidro" na veia e começar a recolher o sangue lentamente por aspiração com a boca. É importante ter solução + APBS heparina na "agulha de vidro", pois isso vai impedir a coagulação do sangue e entupimento da ponta da agulha.
7. 1-2 mL de sangue podem ser obtidas a partir de um sapo de tamanho médio.
8. A pequena incisão na perna do sapo não precisa ser costurada ea ferida cicatriza em uma semana.
9. Centrifugar o sangue a 1.000 rpm por 10 min a 4 ° C.
10. Remover o sobrenadante e lavar as células 1X com 10 mL de APBS frio.
11. Sobreposição de 2 mL de sangue (1-5 x 10 ⁶ células) em 1 mL de Ficoll Histopaque 1,077 (Sigma) pré-aquecido em temperatura ambiente, a fim de separar os leucócitos do sangue a partir de células vermelhas do sangue.
12. Centrifugar 20 min a 1.000 rpm em temperatura ambiente, sem freio, e depois recolher a banda de leucócitos.
13. Lavar as células com 2X APBS por centrifugação a 1.400 rpm por 10 min a 4 ° C para remover o Ficoll residual.
14. Neste ponto as células estão prontas para serem coradas com anticorpos para a análise de citometria de fluxo, ou para ser usado para ensaios em cultura in vitro.

8. Ensaio de Transplante de tumor

1. Cerca de uma semana antes do degelo experimentar um novo lote de 15 / 0 células tumorais e certifique-se que as células começam a crescer também. Meio de cultura é descrito sucintamente na próxima seção e com mais detalhes em ^3.
2. Expandir as células 15 / 0 tumor.
3. No dia do experimento, a contagem de células e determinar a morte celular por exclusão do azul Trypan. Morte celular deve ser inferior a 5%. Lave as células em 1X APBS frio, e centrifugar a 1.000 rpm a 4 ° C por 10 min.
4. Ressuspender as células em meio de cultura tumor com uma densidade de 5 x 10 ⁵ 15 / 0 células por 300 ml.
5. Transplante de 5 x 10 ⁵ células em 300 mL de volume por rã por injeção subcutânea utilizando um calibre 25 08/05 agulha em um lado do lado (back) dorsal do animal.
6. O crescimento do tumor vai começar dentro de 2-3 semanas após o desafio tumor. O aparecimento do tumor inicial deve ser observado e que o volume do tumor deve ser registrada a cada 2-3 dias. Volume tumoral (altura, comprimento X largura X) é medido com paquímetro.
7. Uma vez que o tumor cresce a 3.500 mm ³ ou o sapo começa a olhar letárgico, ele precisa ser sacrificado para evitar desconforto.

9. Reagentes necessários:

• Anfíbios Tampão fosfato salino (APBS): 6,6 g / L NaCl, 1,15 g / L Na ₂ HPO _4, 0,2 g / L KH ₂ PO. pH para 7,5 utilizando NaOH 10N e filtro esterilizado 0,2 m através do filtro.
• Tricaina Sulfonato de Metano (TMS, MS-222) (Crescent Pesquisa Química CAS # 886-86-2).
• Bicarbonato de sódio (Fisher Scientific-S 233-500).
• Histopaque-1077 (Sigma-Aldrich 10771-100 mL)
• Heparina sal de sódio (Sigma-Aldrich H3149-50KU)
• Meio de cultura para Xenopus 15 / 0 tumores [ver 3 para mais detalhes]: 1 L de meio DMEM Iscove basal (Gibco-Invitrogen 11965) com 10 mL de insulina, 10 mL não-aminoácidos essenciais, 10 mL de penicilina-estreptomicina, 10 mg / mL de canamicina, 3 mL de primatone (Sheffield Divisão de Produtos), 1 mL de β2-mercaptoetanol, e 3,02 g NaHCO ₃ em água (pH 7,0). Este meio é diluído para osmolaridade anfíbios, adicionando 30% de água bidestilada, e suplementada com 5% de soro fetal bovino, superantant 20% a partir de uma linha A6 Xenopus rim celular, e 0,25% do normal Xenopus soro.

10. Resultados representante

Figura 1. Análise estereoscópica de rejeição do enxerto de pele 12 dias pós-transplante. LG-6 sapo clonado recebeu um enxerto de pele de ambos (A) um MHC-idênticos LG-6 (não mostra rejeição) ou (B) um doador de MHC-díspares outbred (80% de rejeição). Setas mostra células pigmentadas iridophore prateado marcação saudável do tecido (não rejeitada) enxertados. (*) Marcos de não pinças, devido à rejeição.

Figura 2. Gp96 facilita a apresentação cruzada de antígenos de tumor em Xenopus. LG-15 PLs (5 x 10 ⁵⁾ foram pulsado de 1 hora no gelo ou com APBS (controle negativo), 1 mg de recombinante gp96 purificada a partir de um E. Cultura coli, ou 1 ou 0,5 mg de gp96 purificada a partir de 15 / 0 tecido tumoral. Após 3 lavagens, as células foram transferidos para destinatários adotivamente LG-15 para adultos (1 x 10 ⁶ individual /). Três dias depois, ao vivo 15 / 0 células tumorais (5 x 10 ⁵⁾ foramtransplantado por injeção sc. Cada curva representa a cinética de crescimento do tumor em um sapo. Dias após o desafio, quando apareceu pela primeira vez tumores foram monitorados, eo tamanho do tumor foi determinada periodicamente com um (comprimento x largura x espessura) paquímetro.

Discussão

O anfíbio Xenopus é um exclusivo modelo de não-mamíferos versátil para estudar a imunidade. Sua ampla utilização na pesquisa biomédica e imunológicos rendeu em muitas ferramentas de pesquisa importantes, como os clones MHC definido LG-6 e LG-15, bem como linhas de células diferentes e anticorpos monoclonais. Usando essas ferramentas nós estabelecemos diferentes in vitro e em ensaios in vivo para estudar a capacidade das proteínas de choque térmico, como gp96 para mediar potente Ag-esp...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Reagentes necessários:
Salina Tamponada com Fosfato para Anfíbios (APBS):
NaCl, 1,15 g/L
Na2HPO4, 0,2 g/L
KH2PO
NaOH 10 N
Tricaina Metano Sulfonato (TMS, MS-222)	Crescent Research Chemicals	CAS#886-86-2
Bicarbonato de sódio	Fisher Scientific	S-233-500
Histopaque-1077	Sigma-Aldrich	10771	100 ml
Sal de Sódio da Heparina	Sigma-Aldrich	H3149-50KU
Meio de cultura para tumores Xenopus 15/0 [ver 3 para mais detalhes]:
Meio basal Iscove DMEM	GIBCO, da Life Technologies	11965
Insulina
Aminoácidos não essenciais
Penicilina-estreptomicina
Kanamicina
Primatone	Divisão de Produtos Sheffield
β2-mercaptoetanol–etanol
NaHCO₃
30% água destilada duplamente
5% soro bovino fetal
20% do sobrenadante de uma linhagem celular de rim de Xenopus, A6
0,25% de soro normal de Xenopus
Materiais e Equipamentos:
Tubos cónicos estéreis de centrífuga de 50 e 15 ml
agulhas estéreis Precision Glide de 25 mm de diâmetro e 5/8 de polegada	BD Biosciences
18 gauge 1½ Aguilhas estéreis Precision Glide	BD Biosciences
Seringa estéril de 1 ml com ponta lisa para tuberculina	BD Biosciences
Seringa estéril com ponta de encaixe de 10 ml	BD Biosciences
Tubos de microcentrífuga de 1,5 ml (esterilizados)
Placas de Petri de poliestireno estéreis, 60 x 15 mm	Falcon BD
Lâminas de barbear
Lâminas de microscópio premium 25 x 75 mm x 1 mm	Fisher Scientific
placas de Petri de vidro de 10 cm
9" Pipetas Pasteur Descartáveis de Vidro Borossilicato Durex com Tampão de Algodão	VWR international
Tubulação Tygon
Dois joalheiros suíços nº 5’s Pinça	Miltex Inc.
Tesoura cirúrgica microdissecante McPherson-Vannas com borda reta de corte de 6 mm	Roboz Surgical Instruments Co.
paquímetros Helios
Microscópio de dissecação
Iluminador de alta intensidade
Hemocitômetro
Desligar o bico de Bunsen
37°incubadora com agitação
Centrifugação