DNA-Stable Isotope Probing (DNA-SIP)

1. Preparação dos Reagentes

DNA-SIP requer o uso de reagentes que devem ser preparadas com antecedência do procedimento real. As instruções para preparar cada reagente estão listados nesta seção e são modificadas a partir de um anterior protocolo SIP ^1.

1. Cloreto de césio solução (CsCl) para preparar gradientes SIP - Prepare uma solução 7,163 M CsCl gradualmente dissolvendo 603,0 g de CsCl em água destilada e deionizada (DDH ₂ O) para um volume final de 500 mL. Tenha cuidado para não exceder 500 mL! O aquecimento da solução ligeiramente, agitando irá ajudar a dissolver todos os CsCl. Alíquota a solução final em alíquotas selado. Em nosso laboratório, uma prática comum de armazenamento é preparar 100 mL em alíquotas de 125 mL frascos de soro, que são então friso fechados com rolhas de borracha butílica. As alíquotas selada pode ser armazenado indefinidamente à temperatura ambiente (20 ° C). Os selos ajudar a prevenir a evaporação e CsCl "crust" de formação. Determinar a densidade da solução através de pesagem triplicado 100 mL alíquotas, ou usando um refratômetro digital (por exemplo, Reichert AR200), que foi cuidadosamente calibrado para soluções de CsCl. Uma vez calibrado com sucesso, o AR200 Reichert é consistente e fornece leituras precisas por vários anos. À temperatura ambiente (20 ° C), a densidade final desta solução geralmente varia 1,88-1,89 g ml ^-1. A densidade varia um pouco cada vez que um novo material é preparado.
2. Solução de cloreto de césio para preparar gradientes com brometo de etídio (EtBr) - Combine 250 g de CsCl com 250 mL de água estéril DDH O _2. Solução alíquota isso em separado frascos de soro que foram friso, selada com selos de borracha butílica, conforme descrito no ponto 1.1.
3. Tampão gradiente - Combine 50 ml de 1 M Tris-HCl, 3,75 g KCl e 1 ml de 0,5 M EDTA a 400 ml de água. Dissolver o KCl, em seguida, adicione DDH ₂ O para 500 ml. Filtro de esterilizar e autoclave. A solução final é de 0,1 M Tris, 0,1 M KCl e 1 mM EDTA.
4. Solução de polietileno glicol (PEG) - Prepare a solução de PEG por dissolver 150 g de polietileno glicol 6000 e 46,8 g de NaCl em água estéril DDH O ₂ para um volume total de 500 mL (PEG 30%, 1,6 M NaCl). Autoclave.
   Nota: Esta solução separa em duas fases com autoclave. Incluir uma barra de agitação na garrafa autoclavado para que a solução possa ser devidamente misturados quando isso ocorre.
5. TE buffer - Prepare uma solução de 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) e 1 mM EDTA (pH 8,0) em estéril de água DDH O _2, utilizando as soluções estoque autoclavado de 1 M Tris-HCl (pH 8,0) e 0,5 M EDTA ( pH 8,0). Filtro de esterilizar e autoclave.
6. Etanol 70% - Combine 350 ml de etanol de alta pureza, com 150 ml de água estéril DDH O _2.

2. A incubação de amostras e de extração de DNA

Para o DNA-SIP incubações, as amostras são geralmente incubadas com heavy-isótopos de carbono ⁽¹³ C) substrato. Períodos de incubação e condições (por exemplo, nutrientes suplementação, luz, humidade) irá variar dependendo do tipo de amostra é incubada e que a natureza do substrato. DNA-SIP experimentos foram realizados com sucesso utilizando uma variedade de compostos de carbono simples ^2,3, multi-carbono compostos ^4,5,6, e usando nitrogênio rotulados ^7,8 ou oxigênio ^9. No entanto, uma desvantagem de usar ^{15 N-18} ou O-rotulados compostos é a separação física diminuiu de ácido nucléico marcado, principalmente devido à presença de menor número de átomos de nitrogênio e oxigênio no DNA e RNA em relação ao carbono.

Um controle crítico para DNA-SIP experimentos é uma incubação idêntica estabelecida com substrato (por exemplo, ¹² C) nativa. Esta incubação fornece uma posterior comparação para assegurar que a rotulagem aparente de ácido nucléico não era um artefato da ultracentrifugação ou G + C diferenças de densidade no conteúdo de DNA contribui para a separação ^10. Também é importante para manter o material de amostra congelada para a comparação com 'light' e DNA "pesado", e vale a pena, incluindo um controle não-substrato para avaliar as mudanças de fundo em toda a população de incubação SIP.

1. Incubar amostras ambientais em microcosmos contendo substrato rotulados (Figura 1). Em nossa experiência, descobrimos que uma incorporação mínima de entre 500-500 mmol de ¹³ C de carbono por grama de amostra será adequado para amostras contendo alta biomassa, tais como amostras de solo ^1. Para amostras contendo menos aquáticos biomassa do que solos, 100-100 mmol de incorporados ^de carbono ¹³ C por litro pode produzir uma assinatura isotópica heavy-detectável ^1. A quantidade de emenda de carbono, a proporção de carbono incorporadas biomassa ea necessidade de adição de nutrientes suplementares para assimilação tudo vai depender das características das amostras sendo analisadas e os o alvorganisms de interesse. Um único conjunto de diretrizes de incubação da amostra não será aplicável para todas as amostras. Importante, a concentração do substrato utilizado para a incubação SIP deve idealmente ser o mais próximo possível com a concentração normalmente encontrados in situ; viés experimental pode ser uma conseqüência das condições de enriquecimento de cultura ^10.
2. Após a incubação da amostra com substrato de isótopos estáveis ​​rotulados, extrair DNA de microcosmos utilizando um protocolo rigoroso de extração (por PCR ou clonagem inserir pequenos) ou uma lise enzimática de confiança de alto peso molecular clonagem (por exemplo, de grande inserção metagenomics). RNA co-extração geralmente não afetam a análise, e protocolos que produzem RNA, bem como o DNA pode ser usado. A ultracentrifugação do DNA extraído não cisalhamento fragmentos mais curtos do que ~ 50 pares kb ^1.
3. Quantificar DNA extraído antes da instalação dos tubos de ultracentrifugação CsCl gradiente. Quantificar DNA usando um espectrofotômetro (por exemplo, Nanodrop 2000) se o protocolo de extração de DNA gera apenas (por exemplo coluna baseada em kits). Alternativamente, quantificar usando eletroforese em gel de agarose.

3. Soluções para preparar Gradient Ultracentrifugação

Este procedimento envolve a adição de DNA para ultracentrífuga tubos. Há mais de um tipo de tubo e rotor de modo que o protocolo exato vai variar e dependerão as instruções do fabricante. Dito isto, recomendamos a utilização de um rotor vertical-bem para garantir a separação máxima possível de DNA leves e pesados. Nós usamos um Beckman-Coulter Vti 65,2 rotor com 16 poços para a realização de 5,1 ml tubos Polyallomer QuickSeal eo protocolo irá fornecer os passos e considerações para estas condições.

1. Usando as concentrações de DNA determinada no passo 2.3, calcular o volume necessário de DNA extraído, que é obrigada a fornecer 0,5 mg - 5 mg de DNA em tubos de ultracentrífuga.
2. Combine DNA extraído (0,5 - 5 mg) com tampão Gradiente (veja o passo 1.3) e 4,8 ml de 7,163 M CsCl para um volume total de aproximadamente 6 ml em um tubo estéril de 15 ml descartáveis. Note-se que a densidade da solução de CsCl pode variar até mesmo na mesma molaridade (ver passo 1.1). A seguinte equação pode ser usada para determinar o volume de mistura Gradient Buffer / DNA que é necessária para gerar uma relação adequada de mistura:
   
   Gradiente de volume de solução-tampão e DNA (ml) = (CsCl densidade da solução estoque - densidade desejada final) x volume de solução estoque CsCl acrescentou x 1,52
   
   Especificar o volume de solução estoque CsCl em 4,80 ml. A densidade final desejada deve ser 1,725 ​​g ml ^-1. A densidade da solução estoque foi determinada no passo 1.1.
   
   Note também que os volumes relativos de CsCl e Gradiente Buffer / DNA irá resultar em um volume combinado de mais de 5,1 ml. Preparar volumes superiores a capacidade de volume máximo dos tubos ultracentrífuga (maior que 5,1 ml) para garantir que não há solução suficiente para encher completamente o tubo.
3. Misture por inversão 10 vezes. DNA é estável à temperatura ambiente em CsCl.

4. Criando um gradiente de controle EtBr (opcional)

EtBr porque é um corante que intercalando complexos com DNA tornando-se visíveis sob luz UV, gradientes de controle contendo EtBr são úteis porque fornecem confirmação visual imediata de formação de gradiente antes de fracionamento de tubos de amostra (eg Figura 1). A inclusão de um tubo controle contendo EtBr e uma mistura de ambos DNA ¹² C e ¹³ C-DNA (ou ^DNA-14 N e ¹⁵ N-DNA) permite a visualização imediata da formação da banda dentro dos tubos após a conclusão da ultracentrifugação. Isto é importante porque um tubo rompido durante a ultracentrifugação ou condições de executar incorretamente programadas podem resultar na formação de gradiente falhou. Ligado ao DNA, EtBr diminui a densidade do DNA e, como resultado, um protocolo diferente é seguido para preparar gradientes. Note-se que outras manchas de ácido nucléico pode ser usado em vez de EtBr ^11, mas o protocolo exigirá otimização com fluoróforos outros.

1. O gradiente de controle requer dois volumes do DNA genômico: um totalmente marcada com isótopos estáveis ​​e um sem rótulo. Nós tipicamente usam os Sinorhizobium meliloti cultivadas em meios contendo ^{13 C-12} ou C-glicose como única fonte de carbono, ou Bath tensão Methylococcus capsulatus cultivadas na presença de ¹³ ou ^C-12 C-metano como nossos controles.
2. Combine a 5 mg -10 quantidade de ambos os ¹² C-DNA e ^DNA-13 C com tampão de Gradient para um volume final de 1,00 ml em 15 ml descartáveis ​​tubo de tampa de rosca.
3. Adicionar 1,00 g de CsCl sólido para o mesmo tubo. Misture por inversão.
4. Adicionar 110 mLde um mg 10 ml ^-1 solução EtBr e 4,3 ml de uma ml g 1 ^-1 solução estoque CsCl ao tubo de tampa de rosca mesmo utilizado no passo 4.2. A densidade final da solução aproximada da solução estoque original CsCl.
5. Um adicional de solução de controle "em branco" contendo EtBr também será necessária para contrabalançar a solução criada no passo 4.4. Combine 1,00 mL de tampão Gradiente, 1,00 g de CsCl, 110 mL de uma ml 10 ^-1 mg solução EtBr e 4,3 ml de uma ml g 1 ^-1 solução estoque CsCl em um tubo de 15 ml em separado tampa de rosca e misturar por inversão.

5. Ultracentrifugação

1. Utilizando uma lâmpada e Pasteur pipeta, preencha cuidadosamente os tubos com as soluções de ultracentrífuga gradiente preparada no passo 3.2 (ou 4.4, se preparando passos de um gradiente de controle EtBr). Adicione cuidadosamente as soluções para os tubos utilizando uma pipeta Pasteur. Identifique os tubos no ombro tubo com um marcador permanente fino. CUIDADO: Certifique-se que os tubos são preenchidos exatamente à base do pescoço do tubo. Tubos insuficientemente preenchidos são susceptíveis de explosão durante a ultracentrifugação.
2. Quando todos os tubos necessários estão cheios de exemplos de soluções, registrar a massa precisa de cada tubo. Tubos par e equilibrá-los dentro de 00-10 mg. Para o equilíbrio, encontrar pares quase combinado e adicionar ou remover pequenas quantidades de solução até que sejam equilibradas, mantendo o nível da solução o mais próximo possível da base do pescoço do tubo possível. Note-se que para a pesagem de tubos, usamos uma invertida de 15 ml tubo de tampa de rosca que foi cortada ao meio como um suporte de tubos para o equilíbrio.
3. Fechar os tubos usando um 'tubo de topper' de acordo com as instruções do fabricante.
4. Verifique se os tubos estão devidamente selados, invertendo-os e aplicando uma pressão moderada. Pesar os tubos novamente para verificar se eles ainda estão equilibrados após a selagem para dentro de 00-10 mg.
5. Verifique cada rotor bem cuidadosamente para garantir que os poços estão limpos e livres de detritos e poeira que poderiam perfurar a tubos durante a ultracentrifugação.
6. Inserir os tubos no rotor com os pares equilibrados frente um do outro. Registrar a localização de cada amostra de rotor porque o processo de ultracentrifugação pode causar rótulos marcador para ser danificados ou apagados. Cuidadosamente vedação dos poços de rotor, conforme indicado pelo fabricante.
7. Carregue o rotor na ultracentrífuga. Feche a porta ultracentrífuga e aplicar um vácuo. Se estiver usando um Vti 65,2 rotor, definir a velocidade de rotação de 44.100 rpm (~ 177.000 xg _av), a temperatura a 20 ° C tempo, ultracentrifugação e por 36-40 horas. Selecione a aceleração de vácuo, máximo e desligar o freio (garante gradiente não interrompido por desaceleração). Note-se que desligar o freio irá adicionar um adicional de 1-2 horas para o tempo de execução. Note também que menores tempos de execução não pode alcançar a resolução de banda suficiente. Corre ultracentrifugação longa são recomendados, pois eles levam a uma maior resolução de diferentes bandas de ácido nucléico.
8. Imediatamente após a conclusão do processo de ultracentrifugação, remova o rotor com cuidado. Evitando qualquer inclinação ou bater do rotor, remova cuidadosamente os tubos do rotor para evitar incomodar os gradientes dentro dos tubos. Em raras circunstâncias, um tubo vai estourar durante a execução. Se assim for, há uma chance de que os gradientes nos tubos de outras não formam adequadamente. Se um gradiente de controle foi incluído, verifique cuidadosamente esse tubo sob luz UV para confirmar a formação de gradiente. Se o gradiente não formou adequadamente no tubo controle, é melhor repetir todos o passo 5. Note que o tubo controlo EtBr e seu controle em branco pode ser armazenado no escuro e reutilizado por até seis meses. Ter o cuidado de limpar o rotor cuidadosamente de acordo com as instruções do fabricante uma vez que o tubo do estouro foi removido. Não use escovas de metal ou produtos abrasivos para limpar poços de rotor, a fim de evitar riscos aos poços rotor! Rotor específicos escovas e solução de limpeza pode ser comprado de Beckman.

6. Fracionamento gradiente

Existem dois métodos que são usados ​​atualmente para recuperar DNA dos tubos de ultracentrífuga: fracionamento e extração de agulha. Este protocolo só irá descrever o processo de extração de DNA utilizando a técnica de fracionamento. Isto porque para a maioria dos experimentos SIP, DNA marcado não pode ser visualizado com EtBr vez e deve ser detectada através da comparação de luz equivalente e frações pesadas a partir de tubos de amostra múltiplas. A bomba de seringa é altamente recomendado para recuperar frações iguais gradiente de densidade de tubos de ultracentrífuga. Nós usamos uma bomba de infusão modelo BSP (Braintree Scientific Inc.). Uma bomba de baixo fluxo ou uma bomba peristáltica HPLC também pode ser usado.

1. Encher uma seringa de 60 ml estéril com estéril DDH ₂ O contendo corante azul de bromofenol suficiente para fornecer uma cor azul escuro. Coloque a seringa no braço de carga da bomba de seringa.Anexar a tubulação da bomba equipada com um 23 gauge-1 agulha "e ligue a bomba até que alguns DDH ₂ O chegou até o final da Nota de agulha. Que as bolhas de ar nesta fonte DDH O ₂ afetará negativamente o processo de fracionamento.
2. Corrigir um dos tubos de ultracentrifugação para uma posição de aperto. Garantir que o grampo é suficientemente apertada para impedir que o tubo de ser deslocadas, mas não como pressão sobre o tubo que causaria uma liberação da solução de CsCl quando o tubo é perfurado. Perfurar a parte inferior do tubo ao longo da costura tubo usando um medidor de 23 frescos 1 "da agulha. Para obter os melhores resultados, furar o tubo de forma controlada, rápido e confiante. Isto é muito difícil fazer o bem, praticar várias vezes antes de esta é a primeira tentativa com tubos de amostra.
3. Para cada amostra, preparar estéril 12 tubos de 1,5 ml de microcentrífuga com etiquetas indicando o número da amostra ea fração (1-12; pesado à luz). Usando a agulha acoplada para a tubulação da bomba (passo 6.1), furar o topo do tubo no ombro tubo superior, ao longo da costura. Coletar a solução gradiente usando os tubos de microcentrífuga. Como foi executado para o fundo do tubo, furar o tubo de uma forma rápida e controlada. Prática de antemão e ter muito cuidado para usar um movimento controlado para evitar puxar a agulha forçada de passar através do tubo e em um dedo! Use uma taxa de bomba previamente calibrado que renderá 12 x 425 frações mL em 12 minutos (425 min mL ^-1).
4. Use um refratômetro digital (por exemplo, Reichert AR200; recomendado) ou uma balança analítica para verificar a densidade de frações de um gradiente para confirmar a formação de gradiente adequado. Você vai precisar usar ~ mL 50 de amostra para o teste. Que muitas vezes incluem DNA cultura pura em um tubo (como descrito para preparar os gradientes de controle EtBr) para servir como um controle para fracionamento e usar isso para determinação da densidade. Esperar que a densidade na faixa de 1,690-1,760 g ~ ml ^-1, com uma densidade média de 1,725 ​​g ~ ml ^-1.

7. DNA Precipitação

1. DNA precipitado de todas as frações pela primeira adição de 20 mg de poliacrilamida linear como um portador para a precipitação. Misture por inversão. Adicionar 2 volumes de solução de PEG (veja o passo 1) e misturar por inversão. Note-se que um portador de precipitação (por exemplo, o glicogênio ou de poliacrilamida linear) é fundamental para a recuperação quantitativa de DNA a partir de facções gradiente, mas o cuidado deve ser usado se o glicogênio é utilizado como um portador de precipitação para este protocolo. Preparações de glicogênio foram mostrados para ser contaminados com bactérias de ácido nucléico e contaminação pode facilmente confundir a interpretação de frações gradiente SIP ^12.
2. Deixar os tubos à temperatura ambiente por 2 horas para permitir que o DNA precipitar. Se desejado, os tubos podem ser deixados durante a noite a temperatura ambiente.
3. Centrifugar a 13.000 g por 30 minutos com a volta dos tubos voltado para fora do tubo para uma orientação consistente no rotor. Aspirar cuidadosamente e desprezar o sobrenadante. A pelota deve ser visível, mas pode ser muito difícil ver nesta fase. Trabalho sob uma fonte de luz brilhante (por exemplo, lâmpada de mesa) para auxiliar na visualização do pellet.
4. Lave o pellet com 500 mL de etanol 70%. Centrifugar a 13.000 g por 10 minutos. Aspirar cuidadosamente e desprezar o sobrenadante. O pellet será normalmente mais visíveis para essa etapa, mas se dissociam da parede do tubo com mais facilidade.
5. Permitir que o pellet secar à temperatura ambiente por 15 minutos.
6. Suspender a cada pellet em 50 ul de TE buffer (veja o passo 1.5). Correr 5 mL de cada fração em gel de agarose de acordo com protocolos de laboratório padrão.

8. Caracterização fração

O método utilizado para caracterizar as frações do gradiente para avaliar o sucesso de uma incubação SIP irá variar dependendo do laboratório e disponibilidade de equipamentos. Usando um método de impressão digital para alvejar o gene 16S rRNA é uma abordagem comum e métodos como terminal polimorfismo de fragmentos de restrição (T-RFLP) ou eletroforese em gel de gradiente desnaturante (DGGE) são apropriados (Figura 1). Seguindo o protocolo descrito acima, esperamos que o DNA de luz para ser associado com frações 9-11 (~ 1,705-1,720 g ml ^-1) e as impressões digitais de DNA pesado para ser associados em frações 5-8 (~ 1,720-1,735 g ml ^-1 ). Impressões digitais únicas associadas com frações 5-8 de isótopos estáveis ​​amostras incubadas, mas não com substrato nativo controles incubados fornece fortes evidências de ligação entre organismos específicos com o metabolismo do substrato marcado particular. Se o DNA marcado permanece insuficiente para algumas aplicações (hibridização, metagenomics), amplificação de deslocamento múltiplos podem ser usados ​​para produzir maiores quantidades ^13-15 mas isso pode introduzir quimeras no DNA amplificado ^14,16.

DNA típico SIP-resultados irão demonstrar uma separação de DNA rotulados e não rotulados no gradiente formado por ultracentrifugação. Idealmente, a resolução completa do material genético de alto peso molecular (por exemplo, ¹³ C, ¹⁵ N) a partir de materiais sem rótulos serão alcançados. Resolução pode ser testemunhado visualmente, observando a formação da banda em tubos de controle EtBr. As concentrações de DNA genômico recuperados contidas nas frações gradiente individuais também podem ser utilizados para confirmar a formação de gradiente adequado.

Para este protocolo, que incluem os resultados representante da ultracentrifugação de gradiente realizada utilizando ácido nucléico de duas culturas puras (Figura 2). O gradiente fracionado aqui incluída foi elaborada utilizando DNA genômico extraído de S. meliloti (ATCC 1021), e ¹³ C-marcado M. str capsulatus. Bath. Após a recuperação fracionamento ultracentrifugação, e DNA, rotulados e não rotulados DNA genômico separadas em frações respectivo gradiente com diferentes densidades (Figura 2A). Heavy-isótopo DNA rotulados podem ser observados em frações de 4-5, enquanto o DNA é encontrado sem identificação em altas concentrações nas frações 9-10. O DNA de cada fração foi caracterizada por eletroforese em gel com gradiente de desnaturação ¹⁷ e os produtos de PCR-amplificado gerado discretos padrões de bandas correspondentes aos dois organismos incluídos no gradiente (Figura 2B). A densidade das frações variaram de ~ 1,580-1,759 g ml ^-1, e eles são mostrados em ordem decrescente de densidade da esquerda para a direita.

Embora a separação de ¹³ pura e ^C-12 C-DNA pode ser pronunciado (Figura 2), incubações de amostras ambientais podem ser mais difíceis de interpretar. Por exemplo, nós incubadas tundra solos de Resolute Bay (Nunavut, Canadá) com um ^C-12 ou ¹³ C-glicose marcada por um período de 14 dias a 15 ° C. Os géis de agarose de DNA purificado gradiente de fração demonstraram que o DNA genômico foi "manchado" em frações 70-10 para os ^{12 C-13} e C-incubações (Figura 3A e 3C, respectivamente). Neste caso, ¹³ C enriquecimento da biomassa microbiana em particular da taxa só pode ser determinada com uma abordagem como a DGGE dos genes 16S rRNA. Os ¹² C-glicose DNA solo incubado gera padrões semelhantes em todas as frações do gradiente (Figura 3B), mas os ¹³ da amostra C-glicose incubadas gerada DGGE impressões digitais que são exclusivamente associados com as frações 5-8 (Figura 3D). De particular interesse são as bandas conservada indicado pelas setas. Este "phylotype" dominante é consistente em todas as frações do gradiente, mas desloca-se para fracções mais pesadas de DNA obtido a partir de ¹³ C do solo glucose-incubadas. DNA posterior seqüenciamento desta banda e / ou análise de clone biblioteca confirmaria a identidade deste especial gene rRNA 16S e guia metagenomic subseqüentes ou cultivo baseado em abordagens.

Figura 1. Esboço de um experimento envolvendo DNA-SIP de incubação da amostra, extração de DNA, ultracentrifugação gradiente de CsCl densidade e caracterização de DNA com técnicas moleculares.

Figura 2. Resultados esperados para um fracionamento gradiente SIP incluindo DNA de duas culturas puras. (A) Alíquotas de DNA a partir de frações de gradiente 1-12 foram executados em um gel de agarose 1% a partir de um gradiente contendo ¹³ C-marcado M. capsulatus Bath tensão (frações 4-6) e ¹² C-marcado S. meliloti (frações 8-10). Uma escada 1-kb está incluído para comparação (B) DNA amplificado por PCR a partir de frações mesmo foram executados em um gel de DGGE de 10%. Padrões de impressões digitais revelam diferenças distintas entre as frações 5 e 9, por exemplo.

Figura 3. Resultados esperados para fracionamento gradiente SIP de incubações amostra de solo. Alíquotas das frações do gradiente de ambos os solos ¹² C-glicose alterada (A) e ¹³ do solo C-glicose alterada (C) foram executados em gel agarose 1% e uma escada 1-kb está incluído para comparação. DGGE impressões digitais correspondentes para cada uma dessas amostras são mostrados na (B) e (D). Fingerprinting de frações revela enriquecimento da taxa bacteriana particular na amostra ¹³ C-glicose alterada em frações 5-8 (D).