Artigo de método
DNA estável-isótopo sondagem é um método de cultivo independente para identificar e caracterizar as comunidades ativa de microorganismos que são capazes de utilizar substratos específicos. Assimilação do substrato enriquecido em isótopo pesado leva a incorporação de átomos marcados em biomassa microbiana. Ultracentrifugação em gradiente de densidade recupera DNA marcado para jusante análises moleculares.
DNA estável-isótopo sondagem (DNA-SIP) é uma técnica poderosa para a identificação de microorganismos ativos que assimilar substratos de carbono especial e nutrientes em biomassa celular. Como tal, esta técnica de cultivo independente tem sido uma metodologia importante para a atribuição de função metabólica para as diversas comunidades que habitam uma grande variedade de ambientes terrestres e aquáticos. Após a incubação de uma amostra ambiental com isótopos estáveis compostos marcados, extraídos de ácido nucléico é submetido a ultracentrifugação de gradiente de densidade e fracionamento gradiente subseqüentes para separar ácidos nucléicos de densidades diferentes. Purificação de DNA a partir de cloreto de césio recupera rotulados e não rotulados DNA para a caracterização molecular posterior (por exemplo, impressões digitais, microarrays, bibliotecas clone, metagenomics). Este protocolo fornece vídeo JOVE visuais passo-a-passo explicações do protocolo para fracionamento de gradiente de densidade gradiente de ultracentrifugação, e recuperação de DNA rotulados. O protocolo também inclui dados de amostra SIP e destaca dicas importantes e cuidados que devem ser considerados para garantir uma análise de DNA SIP-sucedido.
1. Preparação dos Reagentes
DNA-SIP requer o uso de reagentes que devem ser preparadas com antecedência do procedimento real. As instruções para preparar cada reagente estão listados nesta seção e são modificadas a partir de um anterior protocolo SIP 1.
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Projeto adequado de isótopos estáveis experimentos sondagem é de importância crítica para a obtenção de DNA marcado acima da comunidade de fundo sem rótulo. Considerações sobre a amostra de tempos de incubação, as concentrações de substrato, condições de incubação (por exemplo, nutrientes, teor de umidade do solo), cross-alimentação e replicação têm sido discutidas em outros lugares 10,18 e recomendamos ao leitor consultar estas publicações quando se projeta um incubação SIP. Relacionadas com o protocolo at.......
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Este trabalho foi financiado pelo Projeto Estratégico e Subsídios Descoberta a JDN das Ciências Naturais e Engenharia Council of Canada (NSERC).
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários | |
|---|---|---|---|---|
| Azul de bromofenol | Reagente | Fisher Scientific | BP115-25 | |
| Cloreto de césio | Reagente | Fisher Scientific | BP210-500 | |
| Etanol, grau reagente | Reagente | Sigma-Aldrich | 652261 | |
| Brometo de etídio | Reagente | Sigma-Aldrich | E1510 | |
| Ácido clorídrico | Reagente | Fisher Scientific | 351285212 | |
| Poliacrilamida linear | Reagente | Applichem | A6587 | |
| Polietileno glicol 6000 | Reagente | VWR international | CAPX1286L-4 | |
| Cloreto de potássio | Reagente | Fisher Scientific | AC42409-0010 | |
| Cloreto de sódio | Reagente | Fisher Scientific | S2711 | |
| Pelotas de hidróxido de sódio | Reagente | Fisher Scientific | S3181 | |
| Base Tris | Reagente | Fisher Scientific | BP1521 | |
| Dark Reader | Equipamento | Clare Chemical | DR46B | |
| Microcentrífuga | Equipamento | Eppendorf | 5424 000.410 | |
| Nanodrop 2000 | Equipamento | Fisher Scientific | 361013650 | |
| Bomba de infusão | Equipamento | Braintree Scientific, Inc. | N/A | Número do modelo: BSP Consulte www.braintreesci.com para detalhes de pedido. |
| Selador de tubos | Equipamento | Beckman Coulter Inc. | 358312 | |
| Ultracentrífuga | Equipamento | Beckman Coulter Inc. | ||
| Rotor de ultracentrífuga | Equipamento | Beckman Coulter Inc. | 362754 | |
| Fonte de luz ultravioleta | Equipamento | UVP Inc. | 95-0017-09 | Qualquer fonte de UV é suficiente |
| Protetor facial contra luz ultravioleta | Equipamento | Fisher Scientific | 114051C | |
| Tampões de borracha butílica, cinza | Material | Sigma-Aldrich | 27232 | |
| Tubos de centrífuga | Material | Beckman Coulter Inc. | 342412 | |
| Agulha hipodérmica, 23 gauge, comprimento de 2” | Material | BD Biosciences | 305145 | |
| Tubos microfuga, 1,5 mL | Material | DiaMed | AD151-N500 | |
| Tampas centrais abertas, diâmetro de 20 mm | Material | Sigma-Aldrich | 27230-U | |
| Pipetas de Pasteur, vidro | Material | Fisher Scientific | 13-678-6C | |
| Pontas de pipeta | Material | DiaMed | BPS340-1000 | O número do catálogo é para pontas de 200 μl. Pontas de 10 ou 20 μl podem ser adquiridas na mesma fonte |
| Tubo da bomba com diâmetro interno de 1,5 mm x parede de 1,5 mm | Material | Appleton Woods | ||
| Tubos com tampa rosqueável, 15 mL | Material | DiaMed | AD15MLP-S | |
| Frasco de soro, volume de 125 mL | Material | Sigma-Aldrich | Z114014 | |
| Seringa, 60 mL | Material | BD Biosciences | 309653 |
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