Toxoplasma gondii se converte em uma forma de cisto em resposta ao estresse ambiental, que pode ser imitada em modelos de cultura de tecidos. Este vídeo demonstra técnicas para examinar a formação de parede do cisto, ativando derivadas da medula óssea macrófagos ou alterar o pH de crescimento médio em células de fibroblastos.
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Artigo de método
Toxoplasma gondii Formação parede do cisto no Activated derivadas da medula óssea macrófagos e Condições Bradyzoite
Neste artigo
Resumo
Resumo
Toxoplasma gondii é um parasita intracelular obrigatório que pode invadir qualquer célula nucleada de animais de sangue quente. Durante a infecção, T. gondii dissemina como uma forma rápida replicação chamado tachyzoite. Taquizoítos converter em uma forma de crescimento lento encistados chamado bradyzoite por um processo de sinalização que não está bem caracterizada. Dentro de animais, cistos bradyzoite são encontradas no sistema nervoso central e tecido muscular e representam a fase crônica da infecção. Conversão para bradyzoites pode ser simulada em cultura de tecidos por inanição CO 2, utilizando meio com pH elevado, ou a adição de interferon gama (IFNγ). Bradyzoites são caracterizadas pela presença de uma parede do cisto, a que a lectina Dolichos biflorus aglutinina (DBA) liga. DBA fluorescente etiquetado é usado para visualizar a parede do cisto no parasitas cultivados em fibroblastos humanos prepúcio (HFFS) que tenham sido expostos a baixa emissão de CO 2 e pH médio alto. Da mesma forma, os parasitas que residem no óssea de camundongos derivadas da medula macrófagos (BMMs) exibir uma parede do cisto detectáveis por DBA após o BMMs são ativados com IFNγ e lipopolissacarídeo (LPS). Este protocolo irá demonstrar como induzir a conversão de T. gondii para bradyzoites usando um meio de crescimento elevado pH, com baixa de CO 2 e ativação de BMMs. Células do hospedeiro serão cultivadas em lamínulas, infectados com taquizoítos e quer ativado com adição de IFNγ e LPS (BMMs) ou expostos a um meio de alto pH de crescimento (HFFS) por três dias. Após a conclusão de infecções, células hospedeiras será corrigido, permeabilizadas, e bloqueado. Paredes do cisto será visualizado utilizando rodamina DBA com microscopia de fluorescência.
Protocolo
1. Preparação de fibroblastos humanos prepúcio (HFF) revestido lamínulas
- Coloque uma lamela de vidro estéril redonda sobre o fundo dos poços de uma placa de cultura de 24 poços de tecido.
- Para colher HFFS de um frasco de 150 centímetros confluentes 2, lavar o balão com duas 1X PBS e adicionar 2,5 ml de 0,025% de tripsina-EDTA. Incubar frasco a 37 ° C por 5-10 minutos.
- Tocando o lado do frasco contra a palma da sua mão pode ajudar em destacar as células do frasco. Uma vez que as células têm liberado do frasco, adicionar 150 ml de HFF médio (Modified Dulbecco Eagle Medium [DMEM] com 10% de SFB, 2 mM L-glutamina, e 1% de penicil....
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Discussão
Embora o mecanismo de desenvolvimento bradyzoite não é totalmente compreendido, molecular análises genéticas de T. gondii estágio de conversão em cultura de tecidos tem levado à descoberta de genes que estão envolvidos na formação de cistos bradyzoite 2,3,4. As análises também levaram à observação de que alguns marcadores bradyzoite são expressas em outras condições de estresse prolongado, incluindo o crescimento em macrófagos ativados 5,6. Os métodos acima descrevem como crescer T. go.......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pela Universidade de Wisconsin-Madison Herman I. Shapiro Distinguished Graduados (CMT), NIH prêmio AI072817 (AMP) e American Heart Association Award 0840059N (LJK).....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Albumina sérica bovina | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Dulbecco’Meio de Eagle modificado (DMEM) | GIBCO, da Life Technologies | 11960-051 | |
| Soro bovino fetal (SBF) | Atlanta Biologicals | S11150 | inativar pelo calor |
| Rodamina Dolichos biflorus aglutinina | Vector Laboratories | RL-1032 | |
| Formaldeído (16%) | Polysciences, Inc. | 18814 | |
| Glicina | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-1 | |
| IFNγ | PeproTech Inc | 315-05 | Armazene em alíquotas de uso único |
| L-glutamina (200 mM) | GIBCO, da Life Technologies | 25030 | |
| Lipopolissacarídeo (LPS) | Sigma-Aldrich | L4391-1MG | Armazenar em alíquotas para uso único |
| Lâmina de Microscópio | Fisher Scientific | 12-545-80 12CIR-1 | |
| Penicilina-Estreptomicina | GIBCO, da Life Technologies | 15140 | |
| Meio RPMI 1640 em pó (com L-glutamina, sem bicarbonato) | GIBCO, da Life Technologies | 31800-022 | |
| Triton-X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| Tripsina-EDTA (0,25%) | GIBCO, da Life Technologies | 25200 | |
| Meios de montagem VectaShield com DAPI | Vector Laboratories | H-1200 |
Referências
- Tomida, M., Yamamoto-Yamaguchi, Y., Hozumi, M. Purification of a factor inducing differentiation of mouse myeloid leukemic M1 cells from conditioned medium of mouse fibroblast L929 cells. J Biol Chem. 259 (17), 10978-10980 (1984).
- Matrajt, M., Donald, R. G., Singh, U., Roos, D. S.
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Reimpressões e permissões
