Entrega bacteriana de RNAi Effectors: Transkingdom RNAi

Resumo

Para o desenvolvimento de interferência de RNA (RNAi) baseado em terapias, uma nova estratégia foi desenvolvida, transkingdom RNAi (tkRNAi). Esta tecnologia utiliza bactérias não-patogênicas de produzir e entregar terapêutica curto hairpin RNA (shRNA) em células-alvo. Aqui, tkRNAi foi aplicado com sucesso para a reversão de multirresistência clássica ABCB1 mediada (MDR) de células cancerosas.

Resumo

Interferência de RNA (RNAi) representa um mecanismo de alto eficaz para inibição específica de expressão de mRNA. Além de seu potencial como uma ferramenta poderosa de laboratório, a via RNAi parece ser promissor para uso terapêutico. Para o desenvolvimento de interferência de RNA (RNAi) baseado em terapias, a entrega de RNAi-agentes mediadores de células-alvo é um dos grandes obstáculos. A nova estratégia para superar este obstáculo é transkingdom RNAi (tk RNAi). Esta tecnologia utiliza bactérias não-patogênicas, por exemplo, Escherichia coli, para produzir e entregar terapêutica curto hairpin RNA (shRNA) em células-alvo para induzir RNAi. A primeira geração tk RNAi-mediadora vector TRIP, contém o bacteriófago T7 promoter de regulação da expressão de um shRNA terapêutico de interesse. Além disso, TRIP tem o locus de Inv Yersinia pseudotuberculosis, que codifica invasin, que permite que as bactérias naturais não-invasivo para entrar β1 positiva de integrina células de mamíferos eo gene HlyA de Listeria monocytogenes, que produz listeriolisina O. Esta enzima permite que o shRNA terapêuticas para escapar entrada vesículas no citoplasma da célula-alvo. Constrói TRIP são introduzidos em um competente coli cepa não-patogênica coli, que codifica T7 RNA polimerase necessário para a síntese T7 promoter-driven de shRNAs. A molécula-alvo bem caracterizado de câncer associados para diferentes estratégias RNAi é ABCB1 (MDR1/P-glycoprotein, MDR1/P-gp). Esta ABC-transportador atua como uma bomba de extrusão de drogas e media o "clássico" resistência a múltiplas drogas ABCB1 mediada (MDR) fenótipo de células de câncer humano, que é caracterizado por um padrão específico de resistência cruzada. ABCB1 expressando diferentes células de câncer de MDR foram tratados com anti-ABCB1 expressão shRNA vector rolamento E. coli. Este procedimento resultou na ativação das vias RNAi nas células do câncer e de um regulamento considerável para baixo do mRNA codificação ABCB1, bem como a bomba de extrusão correspondente drogas. Assim, a acumulação de drogas foi reforçada no pristine células resistentes a drogas câncer eo fenótipo MDR foi revertida. Por meio deste modelo os dados fornecem a prova de conceito que tk RNAi é adequado para a modulação de câncer de fatores associados, como por exemplo ABCB1, em células de câncer humano.

Protocolo

1) Entrega bacteriana da shRNAs

1. Antes de iniciar com a cultura bacteriana, um tem que se preparar LB médio e LB-ágar.
2. Para o LB médio pesar extrato de levedura (0,5% w / v), Bacto triptona (1,0% w / v) e NaCl (0,6% w / v) e diluir estes componentes em água bidest. As soluções preparadas têm que ser esterilizados em autoclave e são, então, pronto para uso.
3. Para LB-agar agar Bacto placas (1,5% w / v) tem de ser adicionado à LB médio anteriores à esterilização.
4. Aquecer LB-ágar no microondas até que o LB-ágar esteja completamente dissolvido. Deixe a solução esfriar até que a garrafa pode ser tocado facilmente sem se queimar. Adici....

Discussão

O número de células semeadas para a infecção e os MOI correspondentes utilizados, dependem criticamente as linhas de células sob observação e sua velocidade de crescimento. Para encontrar o número de células ideal para a semeadura, a pré-experimentos para determinar a velocidade de crescimento são fortemente recomendados. Além disso, MOIS diferentes devem ser testados, devido à limitada estender-se que as células podem suportar a invasão bacteriana sem morrer de stress. O ponto ótimo de tempo em que a regulação para bai.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Ágar	Biochrom AG	214050
Anfotericina B	Biochrom AG	A2612
Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco – PBS (10 x)	Invitrogen GmbH	14080048
E. coli ceq221	Cequent Pharmaceuticals Inc.		Sem catálogo disponível, pedido direto
Gentamicina	Biochrom AG	A2710
Penicilina/Estreptomicina	Invitrogen GmbH		Contém 5.000 unidades de penicilina (base) e 5.000 μg de estreptomicina (base)/ml, utilizando penicilina G (sal de sódio) e sulfato de estreptomicina em solução salina a 0,85%.
Cloreto de sódio	Merck KgaA	1064060500
Triptona	Difco Laboratories	211705
Extrato de levedura	Difco Laboratories	212750