Na eletroporação utero é um método valioso para transfecting células progenitoras neuronal in vivo. Dependendo da colocação dos eletrodos e do ponto no tempo de desenvolvimento de eletroporação, certos subgrupos de células corticais podem ser alvo. Células-alvo podem então ser analisados in vivo ou in vitro para efeitos da alteração genética.
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Artigo de método
No útero Eletroporação seguido por Cultura Neuronal primário para estudar a função do gene no subconjunto dos neurônios corticais
Neste artigo
Resumo
Resumo
Estudo in vitro de culturas primárias neuronais permite análises quantitativas de crescimento de neuritos. A fim de estudar como as alterações genéticas afetam conseqüência processo neuronal, ou construções shRNA cDNA pode ser introduzida em neurônios primários via transfecção química ou transdução viral. No entanto, com células corticais primárias, uma piscina heterogêneo de tipos de células (neurônios glutamatérgicos de diferentes camadas, os neurônios inibitórios, células da glia) são transfectadas com estes métodos. O uso da eletroporação no utero para introduzir DNA construções no córtex roedores embrionárias permite a determinados subconjuntos de células a ser alvo: enquanto eletroporação dos primeiros alvos do córtex embrionário camadas profundas do córtex, eletroporação na tarde timepoints embrionárias alvos camadas mais superficiais. Além disso, a colocação de eletrodos diferenciais entre as cabeças dos resultados individuais de embriões na segmentação de regiões dorsal-medial ventral contra-lateral do córtex. Após a eletroporação, as células transfectadas podem ser dissecados, dissociados, e banhado in vitro para a análise quantitativa do crescimento de neuritos. Aqui, nós fornecemos um método passo-a-passo para medir quantitativamente conseqüência processo neuronal em subconjuntos de células corticais.
O protocolo básico para eletroporação no útero tem sido descrito em detalhes em dois artigos JOVE outros do laboratório Kriegstein 1, 2. Nós iremos fornecer uma visão geral do nosso protocolo para a utero eletroporação, focando os detalhes mais importantes, seguido por uma descrição do nosso protocolo que se aplica em eletroporação utero ao estudo da função do gene em conseqüência processo neuronal.
Protocolo
O protocolo básico para eletroporação no útero tem sido descrito em detalhe em outro artigo JOVE do laboratório Kriegstein 1, 2. Esta técnica foi descrita originalmente no laboratório Osumi 3 e nosso protocolo é baseado em uma desenvolvido no laboratório Loturco 4. Nós iremos fornecer uma visão geral do protocolo no nosso eletroporação útero de embriões de ratos, focando os detalhes mais importantes, seguido por uma descrição do nosso protocolo que se aplica em eletroporação utero ao estudo da função do gene em conseqüência processo neuronal.
1. Em Eletro....
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Discussão
Estudo in vitro de culturas primárias neuronais permitem análises quantitativas de crescimento de neuritos. A fim de estudar como as alterações genéticas afetam conseqüência processo neuronal, construções ou shRNA misexpression pode ser introduzida em neurônios primários via transfecção química ou transdução viral. No entanto, com células corticais primárias, uma piscina heterogêneo de tipos de células (neurônios glutamatérgicos de diferentes camadas, os neurônios inibitórios, células da glia) são tran.......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer a Joseph Loturco e Dennis Selkoe para discussões úteis sobre esta técnica. Os autores agradecem os doadores da Fundação Americana de Assistência à Saúde, para apoio a esta pesquisa.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 10X Hanks’ Solução Salina Equilibrada (HBSS) (Ca+2 /Mg +2 livre | GIBCO, da Life Technologies | 14185-052 | |
| 10X Hanks’ Solução Salina Equilibrada (HBSS) (com Ca)+2 /Mg +2 ) | GIBCO, da Life Technologies | 14065-056 | |
| 1 M HEPES pH 7,4 | GIBCO, da Life Technologies | 15630-080 | |
| Placas de Petri 100 x 15 mm | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| Placas de Petri 60 x 15 mm | BD Biosciences | 351007 | |
| Frasco cônico de 15 mL | Sarstedt Ltd | 62-547-205 | |
| Frasco cônico de 50 mL | Sarstedt Ltd | 62-554-205 | |
| Tesoura | Fine Science Tools | 91402-12 | |
| Pinça Padrão | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Pinça Curva | Fine Science Tools | 11273-20 | |
| Pinça Fina | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Tesoura de Vannas | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| .25% Tripsina-EDTA | GIBCO, da Life Technologies | 25200 | |
| Hemocitômetro Reichert Bright-Line | Hausser Scientific | 1490 | |
| Contador Manual de Apoio | Sigma-Aldrich | Z169021 | |
| Dulbecco’Meio de Eagle Modificado (D-MEM) | GIBCO, da Life Technologies | 11960-051 | |
| Soro bovino fetal | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Penicilina-Estreptomicina | GIBCO, da Life Technologies | 15140 | |
| L-glutamina | GIBCO, da Life Technologies | 25030 | |
| Meio NEUROBASAL | GIBCO, da Life Technologies | 21103-049 | |
| Suplemento Livre de Soro B-27 | GIBCO, da Life Technologies | 17504-044 | |
| Suplemento GlutaMAX-I | GIBCO, da Life Technologies | 35050-061 | |
| Solução Reagente de Gentamicina | GIBCO, da Life Technologies | 15750-060 | |
| Paraformaldeído | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Salina Fosfato Tamponada | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Soro de jumento | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| anticorpo beta-III tubulina | Chemicon International | MAB1637 | |
| anticorpo anti-MAP2 | Chemicon International | AB15452 | |
| Donkey Cy3 anti-rato | Jackson ImmunoResearch | 715-166-151 | |
| Anti-galinha Cy2 de jumento | Jackson ImunoResearch | 703-226-155 | |
| DAPI | GIBCO, da Life Technologies | D3571 | |
| Lâminas com Revestimento CC2 e Duas Câmaras | Lab-Tek | 154852 | |
| Meios de Montagem Fluorescentes | KPL Inc | 71-00-16 | |
| Lâminas de microscopia 24 x 60 mm | VWR international | 48393-106 | |
| Esmalte incolor | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
| Ketamina | Henry Schein | 995-2949 | |
| Xilazina | Henry Schein | 4015809TV | |
| buprenorfina | Henry Schein | 1118217 | |
| Picospritzer III | Parker Hannifin Corporation | ||
| Eletroporador de onda quadrada BTX | Fisher Scientific | BTXECM830 | |
| Tweezertrodos, 7 mm, platina | Harvard Apparatus | 450488 |
Referências
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. J Vis Exp. , (2007).
- Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E16 rat embryos. J Vis Exp
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Reimpressões e permissões
