Visualização do Sistema Nervoso embrionárias no Whole-mount Drosophila Os embriões

Resumo

Nós descrevemos o procedimento para preparar encenado Drosophila Embriões para a visualização do sistema nervoso embrionário durante a embriogênese.

Resumo

O embrião Drosophila é um sistema modelo atraente para investigar as bases celulares e moleculares do desenvolvimento neuronal. Aqui nós descrevemos o procedimento para a visualização de Drosophila sistema nervoso embrionário utilizando anticorpos para proteínas neuronal. Uma vez que todo o embrião nervoso periférico e sistema nervoso central estão bem caracterizados no nível de células individuais (Dambly-Chaudière et al, 1986;.. Bodmer et al, 1987;. Bodmer et al, 1989), qualquer aberrações para estes sistemas podem ser facilmente identificados através de anticorpos para diferentes proteínas neuronal. Os embriões em desenvolvimento são coletados em determinados momentos para garantir que os embriões estão em fase de desenvolvimento adequado para visualização. Após a coleta, as camadas externas do embrião, a membrana cório eo envelope vitelínico que envolve o embrião, são removidos antes da fixação. Embriões são então incubados com anticorpos neuronal e visualizados usando fluorescente etiquetado anticorpos secundários. Embriões em estágios 12-17 são visualizados para acessar o sistema nervoso embrionário. No estágio 12 a banda germe CNS começa encurtamento e por etapa 15, o padrão definitivo da comissura foi alcançado. Por estágio 17 os contratos do SNC e do SNP está totalmente desenvolvido (Campos-Ortega et al. 1985). Assim, mudanças no padrão do PNS e sistema nervoso central pode ser facilmente observado durante estes estágios de desenvolvimento.

Protocolo

1. Preparação dos Reagentes

1. Prepare o Buffer PEMFA usando Pipes 100mM, 2mM EGTA, e 1 mM MgSO _4. Ajustar o pH do tampão a 7,0. O buffer PEMFA é esterilizado por filtração e armazenado a 4 ° C.
2. Prepare PBT, adicionando 1 ml de Triton X-100 a 100ml 1x PBS (Phosphate Buffered Saline) (pH 7,0). Armazenar a 4 ° C.
3. Prepare BSA 5% (albumina bovina) com NaAcide 0,01% em 1x PBS (pH 7,0).
4. Prepare a solução salina usando 0,7% de NaCl e 0,03% Triton X-100 em água deionizada.
5. Prepare o fixador, combinando quatro partes tampão PEMFA com 1 parte de formaldeído 37%.

2. Coleta de embriões

Discussão

O embrião Drosophila é um sistema poderoso para investigar as mudanças celulares e moleculares durante o desenvolvimento neuronal. Neste protocolo temos demonstrado como preparar embriões montar toda a imuno-histoquímica. Nós adaptamos este protocolo a partir do protocolo descrito no Carroll e Scott, 1985. Este protocolo também pode ser adaptado para testar outros anticorpos neuronal, mas a otimização de anticorpos deve ser feito. Além disso, defeitos de desenvolvimento do PNS embrionárias e sistema nervoso cen.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
formaldeído 37%	Fisher Scientific	BP531-25
CSP	Developmental Studies Hybridoma Bank
HRP-FITC	Jackson ImmunoResearch	323-095-021
Alexa Fluor 568 Anti-Rato IgG de Cabra	Invitrogen	A-11004
Meio de Montagem Vectashield	Vector Laboratories	H-1000