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1. Preparação dos Reagentes
- Prepare a preparação buffer de dissecção, adicionando os seguintes compostos: 128 mM NaCl, 1mM EGTA, 4 mM MgCl 2, 2mM KCl, HEPES 5mM, sacarose e 36 mM em 1000 mL PH, para 7,2 e filtro de esterilizar.
2. Preparação para o Dissection
- Cubo Siligard: O gel é cortado para cerca de uma polegada de largura, 1 cm de comprimento e cerca de um centímetro de altura. O cubo de gel é colocado numa lâmina de vidro durante a dissecção. Cubos podem ser usados mais de uma vez.
- Pinos: Pinos usados para dissecção precisa ser mais curta. A parte inferior afiada de pinos minutien funciona melhor na dissecção.
- Precisa de uma tesoura afiada primavera microdissecção.
- Precisa de duas pinças de ponta fina.
3. Coleta de larvas
- Wandering 3 de larvas que são expressão de uma proteína GFP vesícula tagged são coletados em uma placa de Petri.
- As larvas são lavados em água deionizada para se livrar de todos os alimentos.
4. Dissecção ao vivo de larvas
- A larva é transferido para o cubo gel dissecção numa lâmina de vidro. Larva é imerso em tampão dissecção.
- Larva é pined no anterior e posterior com dois pinos de bem com o lado dorsal para cima.
- Com uma tesoura de microdissecção, um pequeno corte é feito na linha média, perto da extremidade posterior. A partir desta incisão um corte é feito através do anterior. Usando dois pinos, pino a cutícula corte nas bordas laterais.
- Adicionar uma gota de dissecar buffer. Remova cuidadosamente o intestino, intestinos e órgãos de gordura com uma pinça. A maioria destes tecidos normalmente exsudado durante o corte dorsal.
- Substitua o tampão com tampão dissecar fresco. A larva nunca deve ser seco e deve ser constantemente em dissecar buffer.
- Incubações utilizando marcadores em MitoTracker vivo ou Lyso Tracker é feito neste momento, diluindo-se no marcador o vivo em tampão dissecção. Após a incubação da vivo no marcador lavar a larva dissecados várias vezes (5 lava rápido) usando tampão dissecar fresco.
- Depois de substituir a última lavagem empurrar os pinos para o syligard e imediatamente lamela. As larvas está agora pronto para observação.
5. Imagens ao vivo de larvas dissecadas
- Coloque a lamela e gel para o palco microscópio e imagem usando um microscópio invertido.
- Nós usamos uma lente de 100x para vesículas imagem marcada dentro larval nervos segmentares. GFP expressão no corpos celulares do gânglio ventral é o primeiro avaliado antes de nervos segmentares são gravadas. Se a coloração GFP robusta é observada em corpos celulares no gânglio ventral, os nervos são, então, fotografado e usado para avaliação.
- Utilizando um sistema de visualização dupla com filtros para CFP / YFP ou RFP / YFP e software de visualização dividida que pode, simultaneamente, duas proteínas com a tag de imagem in vivo.
6. Resultados representante
Figura 1:. A imagem representativa mostrando muitas vesículas axonal em muitas faixas axonal dentro de um nervo segmentar larval Observe as bolhas de GFP, o que representa acúmulo axonal.
Figura 2: A imagem representativa mostrando uma única faixa axonal com muitas vesículas axonal dentro de um nervo segmentar larval.