Summary
Dit artikel beschrijft de experimentele procedures gebruikt om de rattenstaart pezen voor te bereiden op biomechanische en mechanobiological studies. Verschillende functies van de belangrijkste stappen in voorbereiding worden gedemonstreerd, te beginnen met afzuiging, doorsnede meten, spoelen en laden in de bioreactor kamer.
Abstract
Rattenstaart pezen (RTO's) zijn een veel voorkomende biologisch model gebruikt in de experimentele in vitro studies op het gebied van pees fysiologie en tendinopathie. Het werken met de weefsels is een uitdaging, want ze zijn erg kwetsbaar, en tot nu toe was er geen rigoureus gedetailleerd protocol voor de isolatie.
Geconfronteerd met deze uitdagingen, hebben we methoden en instrumenten voor manipulatie van de RTO's en controle levensvatbaarheid van het weefsel, steriliteit en integriteit te vergemakkelijken. Dit artikel beschrijft de experimentele procedures gebruikt om de laboranten voor te bereiden op biomechanische en mechanobiological studies. Ons werk is onderverdeeld in vier stappen: extractie, doorsnede meten, spoelen en laden in de bioreactor kamer.
Bij elke stap worden alle procedures, materialen en manipulaties in detail gepresenteerd, zodat ze gemakkelijk kunnen worden gereproduceerd. Bovendien zijn de ontwikkelde specifieke instrumenten gepresenteerd: een manipulatie plaat gebruikt om de laboranten te scheiden, een optische micrometer tot het weefsel positie tijdens de doorsnede meet-en een verankering systeem om de laboranten hechten op een bioreactor.
Tot slot beschrijven we de resultaten die zijn verkregen na meerdere tests om onze werkwijze te valideren. De levensvatbaarheid, de steriliteit en integriteit evaluaties tonen aan dat onze procedures zijn streng genoeg voor de manipulaties van de kwetsbare weefsels, zoals rattenstaart pezen.
Protocol
Voorafgaand aan elke manipulatie, moet je identificeren van de groep van pezen om te worden gebruikt, afhankelijk van het experiment dat u voert en het apparaat tot uw beschikking. Voor ons doel, werden ventrale pezen gekozen omdat ze kleiner en dus makkelijker te manipuleren bij het meten van de doorsnede en passend ze in de bioreactor kamer.
Houdt u er rekening mee dat alle instrumenten worden geautoclaveerd of gesteriliseerd met 70% ethanol. Bovendien is een spray fles met 70% ethanol geplaatst naast elk werk station naar de onderzoekers handschoenen steriliseren voor elke operatie.
Deel 1: Extraction
Na resectie, is de staart zorgvuldig gemanipuleerd door de uiteinden om te voorkomen dat schade aan de weefsels. Ook te behouden levensvatbaarheid van de cellen, worden alle manipulaties uitgevoerd in koude zoutoplossing.
1A) Materialen:
- Koude zoutoplossing (D-PBS)
- Crushed ijs
- Oppervlak beschermer
- Snijplank
- Individuele manipulatie platen
- 2 500 ml gerechten
- 2 2L glazen schalen
- Plakband
- Een pincet
- Een pincet
- Een pincet stand
- Een Paar van de chirurgische schaar
- 1 Scalpel
- Een paar chirurgische schaar
Figuur 1. Individuele manipulatie met oriëntatie identificatie ("P" voor "proximale")
1B) Werk station:
- Spreid het oppervlak beschermer en plaats de snijplank op de top.
- Vul elke twee grotere glazen schalen tot halverwege met crushed ijs en leg ze op het papier.
- Plak een stukje plakband op een hoek van de manipulatie plaat en zich identificeren met een brief aan het proximale uiteinde aan te geven.
- Vul de twee kleine glazen schalen tot halverwege en alle groeven van de manipulatie platen met koude zoutoplossing. Plaats ze in de grote glazen schalen met ijs.
- Organiseren van alle steriele instrumenten op het oppervlak beschermer.
- Breng de staart in een van de glazen schaaltje met zoutoplossing.
1C) Manipulaties:
- Let op de anatomie aan het proximale uiteinde van de staart aan de buikzijde te onderscheiden van de rugzijde. De buikzijde heeft een groter aantal pezen en een bloedvat dat kan worden geverifieerd door zachtjes knijpen de staart om kleine druppels bloed te produceren.
- Met behulp van de chirurgische schaar, knip de huid langs de dorsale zijde van de staart als je wilt het ventrale pezen (of langs de buikzijde als u de dorsale pezen nodig hebben) extract.
- Open de incisie aan het proximale uiteinde en verwijder de huid met behulp van een tang of met uw vingers en door zorgvuldig het manipuleren van de staart eindigt.
- Afspoelen van het bloed en het haar in de zoutoplossing en breng het monster in de resterende glazen schaaltje met verse oplossing. Veranderen handschoenen.
Een dwarsdoorsnede bekeken onder lichtmicroscopie toont de zes pees groepen. Een pees van elke groep is verbonden aan het caudale einde van elke wervel, dus we snijden in de tussenwervelschijf om nieuwe pezen bloot te leggen langs de snede.
Figuur 2. Dwarsdoorsnede van de rattenstaart bekeken onder een lichtmicroscoop. - Snijd het distale uiteinde door het kraakbeen 2-3 wervels korter met chirurgische schaar. Plaats de staart op de snijplank op de zachte weefsels met behulp van een scalpel en dan onmiddellijk te vervangen in de oplossing te snijden.
- Met een pincet, trek een pees van het distale staart.
- Met een zachte vasthouden aan beide kanten, plaats de pees in de individuele manipulatie plaat.
Herhaal de laatste twee stappen tot er geen meer pezen kunnen worden ontward en snijd een wervel korter wanneer er nieuwe weefsels moeten worden blootgesteld.
Deel 2: Cross-sectional area meting 7
Wanneer het weefsel mechanische karakterisatie of stimulatie ondergaat, zijn de mechanische eigenschappen beschreven door het normaliseren van de kracht in de pees op stress. Dit is waarom we evalueren doorsnede.
2A) Materialen:
- Optic Micrometer
- Stereomicroscoop
- Digitale camera
- Edge erkenning en Profile reconstructie-algoritmen 5,6
- Koude zoutoplossing (D-PBS)
- Een 20-200μL Micro volume pipet
- Een Hex sleutel voor optische micrometer aanpassingen
- 2 pincet
/ Files/ftp_upload/2176/2176fig3.jpg "alt =" Figuur 3 "/>
Figuur 3. Optic Micrometer
2B) Werk station:
- Open de software (met digitale camera en algoritmen).
- Plaats de optische micrometer, zodat er genoeg ruimte is om de pees belasting in het apparaat.
- Het organiseren van de instrumenten en glazen schaaltje met de geëxtraheerde pezen dicht bij de hand.
2C) Manipulaties:
- Vul het meten van compartiment met koude zoutoplossing totdat beide anker systemen worden ondergedompeld.
- Breng de pees in het compartiment door houden de uiteinden met een pincet.
- Met behulp van afzuiging via de micro-volume pipet, trek een uiteinde op een moment in het silicium buis. Zuigen tot het einde reikt verder dan de as kragen.
- Draai de as kragen om de buizen te comprimeren en het apparaat te installeren onder de stereomicroscoop.
- Bij 105x vergroting, rek de pezen met inachtneming van het weefsel totdat de plooien zijn niet meer waarneembaar. Stretch door extra 0,40%.
Figuur 4. Tendon projectie op 105x vergroting voor en na het rekken. - Stel de positie en focus om een duidelijk beeld van de pees over een 180 ° rotatie te behouden.
- Maak een foto bij elke 10 ° rotatie zonder wijziging van spanning, focus of positie. Gebruik alleen de roterende as het uitvoeren van de rotatie. Door zijn kegelvorm, kunnen deze stappen worden herhaald op verschillende punten langs de pees.
- Activeer de rand van erkenning en het profiel reconstructie algoritmen om de database die u hebt geregistreerd te analyseren.
- Gratis de pees door het losdraaien van de as kragen en blazen lucht in de silicone buizen met behulp van de micro-volume pipet.
- Plaats de pees op de manipulatie plaat, wederom behandeling door de uiteinden.
- Controleer of de vorm van het verkregen profiel wederopbouw en de waarde van de doorsnede.
Deel 3: Spoelen
Voor het verwijderen van verontreinigingen die zich hebben voorgedaan tijdens de vorige manipulaties, worden de weefsels gespoeld onder bioveiligheid kast.
3A) Materialen:
- Koude zoutoplossing (D-PBS)
- Multiple-groef manipulatie plaat
- Individuele Manipulatie platen
- Plakband
- 2 pincet
- Een pincet stand
3B) Werk station:
- Zet de ventilator in de bioveiligheid kabinet 15 minuten van te voren en reinig de binnenkant met 70% ethanol.
- Breng alle instrumenten in de bioveiligheid kast.
- Stok stukjes plakband op een hoek van iedere individuele plaat om het proximale uiteinde te identificeren.
- Vul alle groeven met een steriele zoutoplossing.
3C) Manipulaties:
- Introduceer de manipulatie plaat met daarin de uitgepakte pees in de kast.
- Met behulp van een pincet, verwijder dan de pees van zijn plaat met een zachte greep op elk uiteinde.
- Dompel en roer voorzichtig de pees in de zoutoplossing van elk compartiment van de meervoudige-groef manipulatie plaat, uitgaande van de dichtstbijzijnde en over te gaan tot de verste groove.
- Tot slot, dompel de pees in een individuele manipulatie plaat.
Deel 4: Laden in de bioreactor kamer
Om te voorkomen dat verdere besmetting, worden de volgende manipulaties ook uitgevoerd in de bioveiligheid kast.
4A) Materialen:
- Bioreactor kamer 4
- Steriel ankers
- Een steriele petrischaal
- Koude cel gekweekte Medium (DMEM)
- Cyanoacrylaat
- 2 pincet
- Pincet stand
- 0,5-10μl Micro-volume pipet
- 1 Liniaal
Figuur 5. Bioreactor kamer
4B) Werk station:
- Sinds de vorige stap werd ook gerealiseerd in bioveiligheid kabinet, het verwijderen van onnodige tools geeft je meer werkruimte.
- Breng alle andere instrumenten in de kast.
4C) Manipulaties:
- Plaats een anker op de manipulatie plaat met de spoel gecentreerd over de pees extremiteit en wond het weefsel op en rond de spoel.
- Rol het anker op en houd het losse uiteinde, terwijl ervoor te zorgen dat het weefsel blijft verbonden aan het anker. Stop na ¾ draai.
- Voer dezelfdestappen met het andere uiteinde.
- Rol beide ankers dan even tot er 6 cm tussen de centers 1.
- Draai de pees om het onder te dompelen in de oplossing en de verankerde secties kort drogen om de mechanische eigenschappen te verbeteren 2-3 mogelijk te maken.
- Giet cyanoacrylaat in de petrischaal en trek 2.5μL in de micro volume pipet.
- Breng een druppel van cyanoacrylaat op de wond-up weefsel, zonder te laten vallen geen lijm in de zoutoplossing. Herhaal dit tot 2 druppels zijn toegepast op elk anker.
- Met de pees nog geheel ondergedompeld, 5 minuten wachten voor de lijm volledig droog is.
- Gedurende deze tijd, vult de kamer compartiment met zoutoplossing.
- Hydrateren alle weefsel met een zoutoplossing om beschadigingen te voorkomen.
- Door het manipuleren van alleen de ankers, de overdracht van de pees in de bioreactor kamer en sluit deze om lekkage en vervuiling tijdens overdracht te voorkomen.
Deel 5: representatieve resultaten:
De uitkomst van het protocol laat zien dat wanneer correct uitgevoerd, onze weefsels strenge isolatie-en voorbereiding van de procedure maakt het mogelijk om weefsel steriliteit, leefbaarheid en integriteit te behouden.
De eerste, met behulp van de eenvoudige en repetitieve extractiemethode, we zijn in staat om de staart pezen halen zonder beschadiging van het collageen-netwerk als het kan worden waargenomen door een microscopische analyse van H & E besmet secties gerealiseerd na de extractie.
Figuur 6. Tendon collageen netwerk na extractie (5 urn langsdoorsnede gekleurd met H & E).
We dan gekweekt pezen tot tien dagen en uitgevoerd steriliteit tests. Elke dag, we plated gebruikt kweekoplossing op agar en geïncubeerd het voor 24 uur. Aangezien er geen bacteriële groei werd waargenomen, concluderen we dat onze manipulaties niet leiden tot besmetting.
Met het profiel reconstructie-algoritme en de optische micrometer, zijn wij in staat om de cross-sectional area schatten binnen een 2% foutmarge van 7.
Figuur 7. Profile reconstructie van een RTT.
Ten slotte hebben we onderzocht met behulp van de levensvatbaarheid Live / DEAD de levensvatbaarheid / cytotoxiciteit Kit voor cellen van zoogdieren na het spoelen stap en na een twaalf-dagen cultuur periode. Aangezien een grote meerderheid van de groene fluorescerende levende cellen zichtbaar waren, kunnen we bevestigen dat onze isolatie procedures succesvol zijn in het behoud van levend weefsel. Dezelfde test werd uitgevoerd twee uur na het bevestigen van de pees in de bioreactor kamer. We geverifieerd dat de uitdroging en lijm aan het anker niet had verspreid in het weefsel tussen de beide ankers.
Figuur 8. Levensvatbaarheid van het weefsel op het anker (groen = levende cellen, rood = dode cellen)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Door de toepassing van deze experimentele procedures, kunnen we een breed scala van gedrag in vitro studies op dit soort van weefsels. Zoals bijvoorbeeld, was een studie over weefseldegeneratie uitgevoerd door de toepassing van de onder-stimulatie tot laboranten voor een periode van tien dagen. Elke dag hebben we geëvalueerd weefsel mechanische eigenschappen in niet-destructieve spanningsrelaxatie tests. Aan het einde waren we in staat om RTT spanning variatie dus observeren en de progressie van de mechanische eigenschappen te analyseren.
Figuur 9. RTT de stress variatie geëvalueerd via ontspanning test (dag 1 tot 10).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit artikel werd ondersteund door NSERC Grant # 299280, IRSST als een beurs aan G. Ouder en FRSQ als een undergraduate student onderzoek toe te kennen aan M. Cyr. Wij danken Yoan Lemieux-Laneville voor het uitvoeren van de manipulaties opgenomen op video.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| D-PBS | Reagent | Wisent Inc. | 311-410-CL | Saline solution |
| Glucose | Reagent | Wisent Inc. | 609-037-EL | Saline solution 1g/L |
| Antibiotics-antimycotics | Reagent | Invitrogen | 15240-062 | Saline solution 1% |
| DMEM | Reagent | Invitrogen | 12800-017 | Culture solution |
| Sodium Bicarbonate | Reagent | Wisent Inc. | 600-105-CG | Culture solution 3.7g/L |
| FBS | Reagent | Wisent Inc. | 090150 | Culture solution 10% |
| Antibiotics-antimycotics | Reagent | Invitrogen | 15240-062 | Culture solution 1% |
| Optic Micrometer | Tool | Custom Made | ||
| Manipulation plate | Tool | Custom Made | ||
| Bioreactor chamber | Tool | Custom Made |
References
- Bennett, M. B., Ker, R., Dimery, N., Alexander, R. Mechanical properties of various mammalian tendons. J. Zool. Lond. A209, 537-548 (1986).
- Dupuis, D. Déshydratation de matrices collagéniques reconstruites in vitro: effets sur les propriétés mécaniques et histologiques [dissertation]. , Québec, Université Laval. Québec. 114-114 (1981).
- Haut, R. C. Age-dependent influence of strain rate on the tensile failure of rat tail tendon. Journal of Biomechanical Engineering. 105, 296-299 (1983).
- Huppé, N., Lessard, J. -L., Langelier, E. A Bioreactor Design for the Mechanobiological Study of Soft Tissue Damage and Repair in Conditions that Provide the Best Approximation of Actual Use. 31st Canadian Medical and Biological Engineering Conference, 2008 Jun 11-12, Montreal, Canada, , Canadian Medical and Biological Engineering Society. (1985).
- Langelier, E., Dupuis, D., Guillot, M., Goulet, F. &, Rancourt, D. Cross-sectional profiles and volume reconstructions of soft tissues using laser beam measurements. J Biomech Eng. 126, 796-802 (2004).
- Lee, T. Q., Woo, S. L. -Y. A new method for determining cross-sectional shape and area of soft tissues. J Biomech Eng. 110, 110-114 (1988).
- Parent, G., Cyr, M., Cousineau-Pelletier, P., Desbiens-Blais, F. &, Langelier, E. Current Techniques for the Evaluation of Cross-Sectional Area in Rat Tail Tendons Generate Significant Errors. 31st Canadian Medical and Biological Engineering Conference, 2008 Jun 11-12, Montreal, Canada, , Canadian Medical and Biological Engineering Society. (1985).
