Summary
En este artículo se describen los procedimientos experimentales utilizados para preparar los tendones cola de rata para los estudios biomecánicos y mechanobiological. Varias características de los principales pasos en la preparación se ha demostrado, a partir de la extracción, corte transversal medida del área, el enjuague y la carga en la cámara del biorreactor.
Abstract
Tendones cola de rata (RTT) son un modelo común biológicos utilizados en la experimentación en estudios in vitro en los campos de la fisiología del tendón y tendinitis. Trabajar con los tejidos es un reto porque son muy frágiles, y hasta ahora no había protocolo rigurosamente detallado de su aislamiento.
Frente a estos desafíos, hemos desarrollado métodos e instrumentos para facilitar la manipulación de RTT y el tejido de control de la viabilidad, la esterilidad y la integridad. En este artículo se describen los procedimientos experimentales utilizados para preparar RTT para los estudios biomecánicos y mechanobiological. Nuestro trabajo se divide en cuatro etapas: extracción, corte transversal medida del área, el enjuague y la carga en la cámara del biorreactor.
En cada paso, todos los procedimientos, materiales y manipulaciones se presentan en detalle para que puedan ser fácilmente reproducidas. Por otra parte, los instrumentos específicos desarrollados se presentan: una placa de manipulación utilizados para separar RTT, un micrómetro óptico para colocar el tejido en la medida del área transversal y un sistema de anclaje para fijar la RTT en un biorreactor.
Por último, se describen los resultados obtenidos después de múltiples pruebas para validar nuestros métodos. Evaluaciones de la viabilidad, la esterilidad y la integridad demostrar que nuestros procedimientos sean lo suficientemente rigurosos para la manipulación de los tejidos delicados, como los tendones de cola de rata.
Protocol
Antes de cualquier manipulación, debe identificar el grupo de tendones que se utilizan en función de la experiencia que están llevando a cabo y el aparato a su disposición. Para nuestros propósitos, los tendones ventral fueron elegidos porque son más pequeños y por lo tanto más fáciles de manipular en la medición de la sección transversal y ajustándolas a la cámara del biorreactor.
Tenga en cuenta que todos los instrumentos son esterilizados en autoclave o con etanol al 70%. Por otra parte, una botella de aerosol que contiene 70% de etanol se coloca al lado de cada estación de trabajo para esterilizar los guantes experimentadores antes de cada operación.
Parte 1: Extracción
Después de la resección, la cola es cuidadosamente manipulada por sus extremos para evitar daños en los tejidos. Además, para conservar la viabilidad celular, todas las manipulaciones se llevan a cabo en solución salina fría.
1A) Materiales:
- Solución salina fría (D-PBS)
- Hielo picado
- Superficie protectora
- Tabla de cortar
- Manipulación de las placas individuales
- 2 500 platos ml
- Dos platos de vidrio 2L
- Cinta adhesiva
- 1 Pinzas
- 1 pinza
- 1 Pinzas de pie
- 1 par de tijeras quirúrgicas
- Un bisturí
- 1 par de tijeras quirúrgicas
Figura 1. Manipulación individual con la identificación de la orientación ("P" de "proximal")
1B) Estación de trabajo:
- Hacia fuera el protector de la superficie y el lugar de la tabla de cortar en la parte superior.
- Llene cada dos grandes platos de cristal a la mitad con hielo picado y colócalos en el papel.
- Pegue un pedazo de cinta adhesiva en una esquina de la placa de la manipulación y se identifican con una letra para indicar el extremo proximal.
- Llena los dos platos pequeños de cristal a mitad de camino y todas las ranuras de las placas de la manipulación con la solución salina fría. Colocarlos en los platos de cristal grande que contenga hielo.
- Organizar todos los instrumentos estériles en el protector de la superficie.
- La transferencia de la cola en uno de los platos de vidrio que contiene una solución salina.
1C) Manipulaciones:
- Observar la anatomía en el extremo proximal de la cola para distinguir la cara ventral de la parte dorsal. La cara ventral tiene un mayor número de tendones y los vasos sanguíneos que puede ser verificado por una leve presión en la cola para producir pequeñas gotas de sangre.
- Con las tijeras quirúrgicas, cortar la piel a lo largo de la cara dorsal de la cola, si se desea extraer los tendones ventral (oa lo largo de la parte ventral si necesita los tendones dorsales).
- Abrir la incisión en el extremo proximal y quitar la piel con las pinzas o los dedos y por la manipulación cuidadosa de los extremos de la cola.
- Enjuague la sangre y el pelo en la solución salina y la transferencia de la muestra en el plato de cristal restante que contiene una solución fresca. Cambiar los guantes.
Una sección transversal se observa bajo microscopio de luz se muestran los grupos tendón de seis años. Un tendón de cada grupo se adjunta al final de cada vértebra caudal, por lo que cortar en el disco intervertebral para exponer los tendones nuevo a lo largo del corte.
Figura 2. Sección transversal de la cola de rata se observa bajo el microscopio óptico. - Corte el extremo distal a través del cartílago 2-3 vértebras más corta con tijeras quirúrgicas. Coloque la pieza en el tablero para cortar los tejidos blandos utilizando un bisturí y luego inmediatamente a colocarlo en la solución.
- Con unas pinzas, sacar un tendón de la parte final distal.
- Con un agarre suave en ambos extremos, el lugar del tendón en la placa de manipulación individual.
Repita los dos últimos pasos hasta que no los tendones más se pueden extraer y cortar una vértebra más corto cada vez que nuevos tejidos necesitan ser expuestos.
Parte 2: corte transversal medida del área 7
Cuando el tejido se somete a la caracterización mecánica o la estimulación, sus propiedades mecánicas están especificadas por la normalización de la fuerza en el interior del tendón con el estrés. Esta es la razón por la que evaluar la sección transversal.
2A) Materiales:
- Micrómetro óptico
- Estereomicroscopio
- Cámara digital
- Borde de reconocimiento y los algoritmos de reconstrucción perfil 5,6
- Solución salina fría (D-PBS)
- 1 20-200μL Micro pipetas de volumen
- Una llave hexagonal de ajuste micrómetro óptico
- 2 pinzas
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Figura 3. Micrómetro óptico
2B) Estación de trabajo:
- Abra el software (Cámara digital y algoritmos).
- Coloque el micrómetro óptico de modo que haya espacio suficiente para cargar el tendón en el aparato.
- Creación de los instrumentos y el plato de vidrio que contiene los tendones extraídos a mano.
2C) Manipulaciones:
- Llenar el compartimiento de medición con una solución salina fría hasta que los dos sistemas de anclaje están sumergidos.
- Transferencia del tendón en el compartimiento mediante la celebración de los extremos con unas pinzas.
- Mediante succión a través de la micropipeta de volumen, sacar un extremo a la vez en el tubo de silicona. Aspirar hasta el final se extiende más allá de los cuellos del eje.
- Apretar los collares de eje para comprimir los tubos e instalar el aparato bajo el microscopio estereoscópico.
- Con una ampliación de 105X, estirar los tendones mientras se observa el tejido hasta que las arrugas ya no son perceptibles. Tramo adicional de 0,40%.
Figura 4. Proyección del tendón con un aumento de 105x, antes y después del estiramiento. - Ajuste la posición y el enfoque para mantener una imagen clara del tendón en un rotación de 180 °.
- Tomar una foto en cada rotación de 10 ° sin necesidad de modificar la tensión, el enfoque o la posición. Utilice sólo el eje de rotación para llevar a cabo la rotación. Debido a su forma de cono, estos pasos se pueden repetir en diferentes puntos a lo largo del tendón.
- Activar el reconocimiento de borde y los algoritmos de reconstrucción de perfil con el fin de analizar la base de datos que ha registrado.
- Libre del tendón aflojando los cuellos del eje y el soplado de aire en los tubos de silicona con la pipeta el volumen de micro.
- Vuelva a insertar el tendón en la placa de la manipulación, una vez más la manipulación por los extremos.
- Verificar la forma de la reconstrucción perfil obtenido y el valor de la sección transversal.
Parte 3: Enjuague
Para eliminar la contaminación que pueda haber ocurrido durante las manipulaciones anteriores, los tejidos se lavan en gabinete de bioseguridad.
3A) Materiales:
- Solución salina fría (D-PBS)
- Múltiples ranura manipulación placa
- Manipulación de las placas individuales
- Cinta adhesiva
- 2 pinzas
- 1 Pinzas de pie
3B) Estación de trabajo:
- Encender el ventilador en el gabinete de bioseguridad 15 minutos de antelación y limpiar las superficies interiores con etanol al 70%.
- Traiga todos los instrumentos dentro de la cabina de bioseguridad.
- Palo trozos de cinta en una esquina de cada placa individual para identificar el extremo proximal.
- Llenar todas las ranuras con una solución salina estéril.
3C) Manipulaciones:
- Introducir la placa de la manipulación que contiene el tendón extraído en el gabinete.
- Con unas pinzas, quite el tendón de su plato con una comprensión suave en cada extremo.
- Sumerja y revuelva suavemente el tendón en la solución salina en cada compartimento de la placa de la manipulación de múltiples ranuras, a partir de la más cercana y de proceder a la ranura más lejana.
- Por último, se sumergen en el tendón de una placa de manipulación individual.
Parte 4: Carga en la cámara de biorreactor
Para evitar una mayor contaminación, las manipulaciones siguientes también se llevó a cabo en la cabina de bioseguridad.
4A) Materiales:
- Biorreactor de 4 cámaras
- Ancla estéril
- Una placa de Petri estéril
- Media celda fría cultivo (DMEM)
- Cianoacrilato
- 2 pinzas
- Pinzas de pie
- 0.5-10μl de micro-pipeta de volumen
- 1 Regla
Figura 5. Biorreactor de cámara
4B) Estación de trabajo:
- Desde el paso anterior se realizó también en gabinete de bioseguridad, la eliminación de herramientas innecesarias le dará más espacio de trabajo.
- Lleve todos los otros instrumentos en el interior del gabinete.
4C) Manipulaciones:
- Coloque un ancla en la placa de la manipulación con su carrete centrado sobre el extremo del tendón y la herida de tejido y alrededor de la bobina.
- Rodar el ancla más y mantener la extremidad suelta al tiempo que garantiza que el tejido permanece unida al ancla. Parar después de ¾ de vuelta.
- Llevar a cabo la mismapasos con el otro extremo.
- Rollo de los dos anclajes en igual hasta que es de 6 cm entre sus centros 1.
- Afloje el tendón que lo sumergen en la solución y permitir que las secciones anclado en seco breve para mejorar sus propiedades mecánicas 2.3.
- Vierta cianoacrilato en la placa de Petri y sacar 2.5μL en la pipeta de volumen micro.
- Aplique una gota de cianoacrilato para el tejido de la herida, sin dejar caer el pegamento en la solución salina. Repita la operación hasta 2 gotas se han aplicado a cada ancla.
- Con el tendón todavía completamente sumergido, espere 5 minutos para que el pegamento se seque por completo.
- Durante este tiempo, para llenar el compartimiento de cámara con solución salina.
- Rehidratar todo el tejido con una solución salina para evitar daños.
- Sólo mediante la manipulación de las anclas, la transferencia del tendón en la cámara de bioreactor y cerrarlo para evitar fugas y la contaminación durante la transferencia.
Parte 5: Resultados del representante:
El resultado del protocolo muestra que cuando se realiza correctamente, el aislamiento del tejido riguroso procedimiento de preparación que sea posible para mantener la esterilidad del tejido, la viabilidad y la integridad.
En primer lugar, utilizando el método de extracción simple y repetitivo, que son capaces de extraer los tendones de cola sin dañar la red de colágeno, ya que puede ser observado por un análisis microscópico de las secciones de H & E contaminada se dio cuenta después de la extracción.
Figura 6. Red de colágeno del tendón después de la extracción (5μm sección longitudinal teñidos con H & E).
A continuación, los tendones se cultivaron durante un máximo de diez días y llevó a cabo pruebas de esterilidad. Cada día, plateado solución utilizada cultivo en agar y se incubó durante 24 horas. Dado que no se observó el crecimiento bacteriano, llegamos a la conclusión de que nuestras manipulaciones no dan lugar a la contaminación.
Con el algoritmo de reconstrucción de perfil y un micrómetro óptico, podemos estimar el área transversal dentro de un margen de error del 2% 7.
Figura 7. Reconstrucción perfil de un RTT.
Finalmente, se evaluó la viabilidad de usar el LIVE / DEAD viabilidad / citotoxicidad kit de células de los mamíferos después del paso de enjuague y después de un período de cultivo de doce días. Dado que una gran mayoría de verde fluorescente las células vivas se hicieron evidentes, podemos afirmar que nuestros procedimientos de aislamiento tienen éxito en la preservación de los tejidos vivos. La misma prueba se llevó a cabo dos horas después de fijar el tendón en la cámara del biorreactor. Se verificó que la deshidratación y la cola en el ancla no se había extendido en el tejido entre los dos anclajes.
Figura 8. Viabilidad de los tejidos en el ancla (verde = células vivas, rojo = las células muertas)
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Discussion
Mediante la aplicación de los procedimientos experimentales, podemos realizar una gran variedad de estudios in vitro de este tipo de tejidos. Como por ejemplo, un estudio sobre la degeneración de los tejidos se llevó a cabo mediante la aplicación de los menores de la estimulación de RTT por un período de diez días. Cada día, se evaluaron las propiedades mecánicas del tejido en los ensayos no destructivos de relajación de tensiones. Al final, hemos sido capaces de observar la variación de estrés RTT y por lo tanto analizar la evolución de las propiedades mecánicas.
Figura 9. Variación de la tensión a través de RTT evaluar la prueba de relajación (días 1 a 10).
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este artículo fue apoyada por NSERC # 299280 Grant, IRSST como una beca para los padres y G. FRSQ como un premio de investigación de estudiantes de pregrado de M. Cyr. Damos las gracias a Yoan Lemieux-Laneville para realizar las manipulaciones grabadas en video.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| D-PBS | Reagent | Wisent Inc. | 311-410-CL | Saline solution |
| Glucose | Reagent | Wisent Inc. | 609-037-EL | Saline solution 1g/L |
| Antibiotics-antimycotics | Reagent | Invitrogen | 15240-062 | Saline solution 1% |
| DMEM | Reagent | Invitrogen | 12800-017 | Culture solution |
| Sodium Bicarbonate | Reagent | Wisent Inc. | 600-105-CG | Culture solution 3.7g/L |
| FBS | Reagent | Wisent Inc. | 090150 | Culture solution 10% |
| Antibiotics-antimycotics | Reagent | Invitrogen | 15240-062 | Culture solution 1% |
| Optic Micrometer | Tool | Custom Made | ||
| Manipulation plate | Tool | Custom Made | ||
| Bioreactor chamber | Tool | Custom Made |
References
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