Summary
Den här artikeln beskriver de experimentella metoder som används för att förbereda senor råtta svans för biomekaniska och mechanobiological studier. Flera funktioner av de viktigaste stegen för att förbereda påvisas, börjar med utvinning, tvärsnittsarea mätning, sköljning och lastning i bioreaktor kammaren.
Abstract
Rat svans senor (RTTS) är en gemensam biologisk modell som används i experimentella in vitro-studier inom senan fysiologi och tendinopati. Att arbeta med dessa vävnader är en utmaning eftersom de är mycket bräckliga, och fram tills nu fanns det ingen rigoröst detaljerat protokoll för deras isolering.
Inför dessa utmaningar har vi utvecklat metoder och instrument för att underlätta hantering av RTTS och kontroll vävnad livskraft, sterilitet och integritet. Den här artikeln beskriver de experimentella metoder som används för att förbereda RTTS för biomekaniska och mechanobiological studier. Vårt arbete är uppdelat i fyra steg: brytning, tvärsnittsarea mätning, sköljning och lastning i bioreaktor kammaren.
Vid varje steg är alla procedurer, material och manipulationer presenteras i detalj, så att de lätt kan reproduceras. Dessutom är de specifika utvecklat instrument presenteras: en manipulation plåt som används för att avskilja RTTS, till en optisk mikrometer för att placera vävnaden under tvärsnittsarea mätning och ett förankringssystem fästa RTTS på en bioreaktor.
Slutligen beskriver vi de resultat som uppnåtts efter flera tester för att validera våra metoder. Genomförbarhet, sterilitet och integritet utvärderingar visar att våra rutiner är tillräckligt stränga för manipulationer av ömtåliga vävnader såsom senor råtta svans.
Protocol
Före varje manipulering, måste du identifiera den grupp av senor som ska användas beroende på vilka experiment du genomför och apparater till ert förfogande. För våra syften, var ventrala senor utvalda eftersom de är mindre och därmed lättare att manipulera vid mätning av tvärsnittsarea och montering dem i bioreaktor kammaren.
Observera att alla instrument är autoklaveras eller steriliseras med 70% etanol. Dessutom är en sprayflaska som innehåller 70% etanol placeras bredvid varje arbetsstation att sterilisera experimentatorerna handskarna före varje operation.
Del 1: Extraction
Efter resektion är svansen noggrant manipuleras av dess yttersta att undvika skador på vävnader. Dessutom, för att bevara cellviabiliteten är alla manipulationer genomförs i kall saltlösning.
1A) Material:
- Kall saltlösning (D-PBS)
- Krossad is
- Yta beskyddare
- Skärbräda
- Individuella manipulation plattor
- 2 500 ml rätter
- 2 2L glas rätter
- Tejp
- 1 pincett
- 1 Tång
- 1 pincett monter
- 1 par kirurgiska saxar
- 1 Skalpell
- 1 par kirurgiska saxar
Figur 1. Individuell manipulation med inriktning identifiering ("P" för "proximala")
1B) Arbete stationen:
- Sprid ut ytan beskyddare och placera skärbräda ovanpå.
- Fyll varje två större glas rätter till hälften med krossad is och placera dem på pappret.
- Stick en bit tejp på ett hörn av manipulation plattan och identifiera sig med en bokstav som anger den proximala änden.
- Fyll två små glas rätter till halvvägs och alla spår av manipulation plattor med kall saltlösning. Placera dem i det stora glaset rätter som innehåller is.
- Organisera alla sterila instrument på ytan beskyddare.
- Överför svans till en av de glasskål som innehåller saltlösning.
1C) modifieringar:
- Observera anatomi vid den proximala änden av svansen för att skilja den ventrala sidan från ryggsidan. Den ventrala sidan har ett större antal senor och blodkärl som kan verifieras genom att försiktigt klämma på svansen för att producera små droppar blod.
- Med hjälp av kirurgiska saxar, skär i huden längs ryggsidan av svansen om du vill extrahera ventrala senor (eller längs den ventrala sidan om du behöver rygg senor).
- Öppna snitt vid den proximala änden och ta bort huden med pincett eller fingrarna och genom att försiktigt manipulera svansen slutar.
- Skölj bort blodet och håret i saltlösning och för över provet till de kvarvarande glasskål med färsk lösning. Byt handskar.
En Tvärsnitt ses under ljusmikroskop visar de sex senan grupper. En sena från varje grupp är knuten till den bakre slutet av varje kota, så vi skär på intervertebral skiva för att exponera nya senor längs snittet.
Figur 2. Tvärsnitt över råttan svansen ses under ljusmikroskop. - Skär den distala änden genom brosket 2-3 kotor kortare med kirurgisk sax. Sätt svansen på skärbräda att skära mjuka vävnader med hjälp av en skalpell och sedan omedelbart ersätta den i lösningen.
- Använda pincett, dra ut en sena från distala svans slutet.
- Med ett lätt mothåll i båda ändar, placera senan i de enskilda manipulation plattan.
Upprepa de två sista stegen tills inga fler senor kan benas ut och skära en kota kortare när nya vävnader behöver utsättas.
Del 2: tvärsnittsarea mätning 7
När vävnaden genomgår mekanisk karakterisering eller stimulans, är dess mekaniska egenskaper beskrivs av normalisering av våld inne i senan till stress. Det är därför vi utvärderar tvärsnittsarea.
2A) Material:
- Optic Mikrometer
- Stereomikroskop
- Digitalkamera
- Edge erkännande och profil algoritmer rekonstruktion 5,6
- Kall saltlösning (D-PBS)
- 1 20-200μL Micro volym pipett
- 1 Insexnyckel för optisk mikrometer justeringar
- 2 Pincetter
/ Files/ftp_upload/2176/2176fig3.jpg "alt =" Bild 3 "/>
Figur 3. Optic Mikrometer
2B) Arbete stationen:
- Öppna programmet (Digital kamera och algoritmer).
- Placera optiska mikrometer så att det finns tillräckligt med utrymme att lasta senan i apparaten.
- Organisera de instrument och glasskål som innehåller de extraherade senor nära till hands.
2C) modifieringar:
- Fyll mäta facket med kall saltlösning tills båda ankare system är under vatten.
- Överför senan i facket genom att hålla i ändarna med pincett.
- Använda sug via mikro-volym pipett, dra en extremitet i taget i kisel röret. Sug till slutet sträcker sig utanför axeln kragar.
- Dra axeln kragar att komprimera rör och installera apparaten under stereomikroskop.
- Vid 105x förstoring, tänja senor med iakttagande vävnaden tills veck inte längre märkbar. Stretch med ytterligare 0,40%.
Figur 4. Sena projektion vid 105x förstoring före och efter stretching. - Justera läge och fokus för att upprätthålla en tydlig bild av senan över en 180 ° rotation.
- Ta ett foto på var 10 grader utan att modifiera spänning, fokus eller position. Använd endast den roterande axeln för att utföra rotation. På grund av sin kon form, kan dessa steg upprepas på olika ställen längs senan.
- Aktivera kanten erkännande och profil algoritmer återuppbyggnad för att analysera den databas du har registrerat.
- Gratis senan genom att lossa axeln kragar och blåsa luft i silikon rören med hjälp av mikro volymen pipetten.
- Sätt senan på manipulation plattan igen hanterar det genom att ändarna.
- Kontrollera formen på de erhållna profilen återuppbyggnad och värdet av tvärsnittsarean.
Del 3: Sköljning
För att ta bort föroreningar som kan ha inträffat under föregående manipulationer, är vävnaderna sköljas av under biosäkerhet skåp.
3A) Material:
- Kall saltlösning (D-PBS)
- Flera-spår manipulation tallrik
- Individuella Manipulation plattor
- Tejp
- 2 Pincetter
- 1 pincett monter
3B) Arbete stationen:
- Sätt på fläkten i biosäkerhet skåpet 15 minuter i förväg och rengör insidan med 70% etanol.
- Ta med alla instrument inuti biosäkerhet skåpet.
- Stick bitar av tejp på ett hörn av varje platta för att identifiera den proximala änden.
- Fyll alla spår med steril koksaltlösning.
3C) modifieringar:
- Introducera manipulation skylt som innehåller de extraherade senan i skåpet.
- Använda pincett, ta bort senor från sin tallrik med en lätt grepp i varje ände.
- Sänk och försiktigt rör senan i saltlösning i varje fack i flera spår manipulation platta, med början från den närmaste och fortsätter till längst spåret.
- Slutligen dränka senan i ett enskilt manipulation tallrik.
Del 4: Fylla i bioreaktor kammare
För att undvika ytterligare kontaminering följande manipulationerna genomförs också i biosäkerhet skåpet.
4A) Material:
- Bioreaktor kammare 4
- Sterila ankare
- 1 steril petriskål
- Kall cell odlade Medium (DMEM)
- Cyanoakrylat
- 2 Pincetter
- Pincett stå
- 0,5-10μl Micro-volym pipett
- 1 Ruler
Figur 5. Bioreaktor kammare
4B) Arbete stationen:
- Sedan föregående steg var också förverkligas i biosäkerhet skåp, borttagning av onödiga verktyg som ger dig mer arbetsyta.
- Ta med alla andra instrument i skåpet.
4C) modifieringar:
- Placera ett ankare på manipulation plattan med sin spole centrerad över senan extremiteter och såret vävnaden upp och runt spolen.
- Rulla ankare över och håll den lösa ändan samtidigt som vävnaden sitter fast på ankaret. Stopp efter ¾ varv.
- Utför sammasteg med den andra änden.
- Rulla både förankrar över lika tills det är 6 cm mellan deras centrum 1.
- Lossa senan att fördjupa det i lösningen och låt förankrade avsnitt för att torka en kort stund för att öka dess mekaniska egenskaper 2-3.
- Häll cyanoakrylat i petriskål och dra 2.5μL i mikro volym pipetten.
- Applicera en droppe cyanoakrylat på såret upp vävnaden utan att tappa någon lim i saltlösning. Upprepa tills 2 droppar har tillämpats på varje ankare.
- Med senan fortfarande helt nedsänkt, vänta 5 minuter för limmet torka helt.
- Under denna tid, fyller kammaren facket med saltlösning.
- Rehydrera alla vävnad med koksaltlösning för att förhindra skador.
- Genom att manipulera bara ankare, överföring senan i bioreaktor kammaren och stäng det för att förhindra läckage och föroreningar under överföringen.
Del 5: representativa resultat:
Resultatet av protokollet visar att när det utförs korrekt, våra vävnader rigorös isolering och beredningen gör det möjligt att hålla vävnader sterilitet, livskraft och integritet.
Först med det enkla och repetitiva brytningsmetod, kan vi utvinna svans senor utan att skada kollagen nätverk som det kan observeras av en mikroskopisk analys av H & E fläckas avsnitt insåg efter extraktion.
Figur 6. Sena kollagen nätverket efter extraktion (5μm längdsnitt färgas med H & E).
Vi sedan odlade senor i upp till tio dagar och genomfört tester sterilitet. Varje dag, ruvade vi pläterade användas kultur lösning på agar och det i 24 timmar. Eftersom ingen bakterietillväxt sågs, drog vi slutsatsen att våra manipulationer inte leda till kontaminering.
Med profilen återuppbyggnaden algoritm och optiska mikrometer, kan vi uppskatta tvärsnittsarean inom en 2% felmarginal 7.
Figur 7. Profil rekonstruktion av en RTT.
Slutligen bedömde vi livskraft använder Live / Dead viabilitet / Cytotoxicitet Kit för däggdjursceller efter sköljning steg och efter ett tolv dagar kulturen period. Eftersom en stor majoritet av grönt fluorescerande levande celler var uppenbara, kan vi konstatera att vår isolering rutiner är framgångsrika i att bevara levande vävnad. Samma test utfördes två timmar efter att fästa senan i bioreaktor kammaren. Vi kontrollerade att uttorkning och lim vid ankaret inte hade spridit sig i vävnaden mellan de båda ankare.
Figur 8. Tissue bärkraft på ankaret (grön = levande celler, röd = döda celler)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Genom att tillämpa de experimentella procedurer, kan vi göra ett brett utbud av in vitro-studier på denna typ av vävnader. Som till exempel, var en studie om vävnad degeneration genomförs genom tillämpning av under-stimulans för att RTTS under en period av tio dagar. Varje dag, utvärderade vi vävnad mekaniska egenskaper i oförstörande stresstester avkoppling. Till slut kunde vi konstatera RTT stressen variation och därmed analysera utvecklingen av mekaniska egenskaper.
Figur 9. RTT: s stressen variation utvärderas tråg avkoppling test (dag 1 till 10).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Denna artikel har stöd av NSERC Grant # 299.280, IRSST som ett stipendium till G. Förälder och FRSQ som en doktorand Research Award till M. Cyr. Vi tackar Yoan Lemieux-Laneville för att utföra manipulationer inspelade på video.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| D-PBS | Reagent | Wisent Inc. | 311-410-CL | Saline solution |
| Glucose | Reagent | Wisent Inc. | 609-037-EL | Saline solution 1g/L |
| Antibiotics-antimycotics | Reagent | Invitrogen | 15240-062 | Saline solution 1% |
| DMEM | Reagent | Invitrogen | 12800-017 | Culture solution |
| Sodium Bicarbonate | Reagent | Wisent Inc. | 600-105-CG | Culture solution 3.7g/L |
| FBS | Reagent | Wisent Inc. | 090150 | Culture solution 10% |
| Antibiotics-antimycotics | Reagent | Invitrogen | 15240-062 | Culture solution 1% |
| Optic Micrometer | Tool | Custom Made | ||
| Manipulation plate | Tool | Custom Made | ||
| Bioreactor chamber | Tool | Custom Made |
References
- Bennett, M. B., Ker, R., Dimery, N., Alexander, R. Mechanical properties of various mammalian tendons. J. Zool. Lond. A209, 537-548 (1986).
- Dupuis, D. Déshydratation de matrices collagéniques reconstruites in vitro: effets sur les propriétés mécaniques et histologiques [dissertation]. , Québec, Université Laval. Québec. 114-114 (1981).
- Haut, R. C. Age-dependent influence of strain rate on the tensile failure of rat tail tendon. Journal of Biomechanical Engineering. 105, 296-299 (1983).
- Huppé, N., Lessard, J. -L., Langelier, E. A Bioreactor Design for the Mechanobiological Study of Soft Tissue Damage and Repair in Conditions that Provide the Best Approximation of Actual Use. 31st Canadian Medical and Biological Engineering Conference, 2008 Jun 11-12, Montreal, Canada, , Canadian Medical and Biological Engineering Society. (1985).
- Langelier, E., Dupuis, D., Guillot, M., Goulet, F. &, Rancourt, D. Cross-sectional profiles and volume reconstructions of soft tissues using laser beam measurements. J Biomech Eng. 126, 796-802 (2004).
- Lee, T. Q., Woo, S. L. -Y. A new method for determining cross-sectional shape and area of soft tissues. J Biomech Eng. 110, 110-114 (1988).
- Parent, G., Cyr, M., Cousineau-Pelletier, P., Desbiens-Blais, F. &, Langelier, E. Current Techniques for the Evaluation of Cross-Sectional Area in Rat Tail Tendons Generate Significant Errors. 31st Canadian Medical and Biological Engineering Conference, 2008 Jun 11-12, Montreal, Canada, , Canadian Medical and Biological Engineering Society. (1985).
