Summary
Wir präsentieren ein Verfahren, mit dem zweidimensionalen Agarose-Gel-Analyse verwendet werden, um die Struktur der Replikation Zwischenprodukte, die nach UV-Bestrahlung auftreten, identifiziert werden können.
Abstract
Ungenaue Replikation in Anwesenheit von DNA-Schäden verantwortlich ist für die Mehrheit der zellulären Umlagerungen und Mutagenese in alle Zelltypen zu beobachten und wird allgemein angenommen, um direkt mit der Entstehung von Krebs beim Menschen in Verbindung gebracht werden. DNA-Schäden, wie sie durch UV-Bestrahlung induziert wird, stark beeinträchtigt die Fähigkeit der Replikation der genomischen Vorlage exakt zu duplizieren. Eine Reihe von Genprodukten identifiziert worden, die erforderlich sind, wenn die Replikation Begegnungen DNA-Läsionen in der Vorlage. Allerdings hat eine verbleibende Herausforderung, wie diese Proteine Prozess Läsionen während der Replikation bestimmen
Protocol
1. Wachstum und UV-Bestrahlung.
- 200 ul einer frischen Übernacht-Kultur, die das Plasmid pBR322 in Davis Medium 1 gewachsen mit 0,4% Glucose, 0,2% Casaminosäuren und 10 pg / ml Thymin (DGCthy mittel) und 100 ug / ml Ampicillin wird pelletiert. Das Zellpellet wird dann in 200 ul DGCthy Medium ohne Ampicillin resuspendiert und verwendet werden, um 20 ml DGCthy Beimpfen.
- Kulturen sind ohne Ampicillin-Selektion in einem Schüttelinkubator bei 37 ° C auf eine OD 600 von 0,5 (~ 5 x 10 8 Zellen / ml) gewachsen. Wachstum ohne Ampicillin verhindert Selektion gegen anormales oder unproduktive Replikation Zwischenprodukte, die in einigen Mutanten entstehen können. Darüber hinaus, wenn mit UV-Licht, um Schäden zu induzieren, ist die Entfernung des Ampicillin aus den Medien notwendig, weil es stark absorbiert bei diesen Wellenlängen und schirmt den Zellen, wodurch die effektive Dosis von UV.
- Arbeiten unter gelb leuchtet, ist die Kultur in einem 15cm Durchmesser Petrischale auf einer rotierenden Plattform für Agitation gestellt. Unsere Kulturen sind in einem Abstand von einer 15-Watt-Entkeimungslampe, dass eine Exposition von ~ 1 J/m2/sec, die mit Hilfe eines UVC Photometer produziert platziert. Die Kulturen werden mit 50 J/m2 bestrahlt und dann sofort wieder in platziert das Schütteln 37 ° C Inkubator für die Dauer des Experiments. Diese Dosis produziert, durchschnittlich 1 Cyclobutan-Pyrimidin-Dimer alle 4,5 kb von ssDNA. Die gelbe Beleuchtung verhindert Photoreaktivierung-Auflösung von Cyclobutan-Pyrimidin-Dimere durch Photolyase.
2. DNA Isolation.
- In Zeiten, in denen die Replikation Zwischenprodukte untersucht werden sollen, ist eine 0,75 ml Aliquot der Kultur in 0,75 ml eiskalter Net30 Puffer (100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 8,0, 30 mM EDTA) gegeben und auf Eis gestellt, bis zum Ende des den zeitlichen Verlauf. Wir starten üblicherweise eine 90-minütige zeitlichen Verlauf, wobei die Proben bei 0 untersucht, 15, 30, 45, 60 und 90 Minuten. Die EDTA und Kälte dienen, effektiv zu stoppen, Replikation und Nukleotidexzisionsreparatur reparieren.
- Jede Probe wird dann pelletiert, resuspendiert in 150 ul von 1,5 mg / ml Lysozym und 0,2 mg / ml RNaseA in TE (10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA), und lysiert bei 37 ° C für 20 min. Zu diesem Zeitpunkt werden 10 &mgr; l Proteinase K (10mg/ml) und 10 &mgr; l von 20% Sarkosyl zugegeben und die Inkubation läßt man 1 h weiter. Proteinase K und Sarkosyl Hilfe von DNA-Fragmenten, die mit der Membran oder Proteine in Verbindung gebracht werden, bevor Phenolextraktion auftritt, kann loslassen. Seit aktiv replizierenden DNA wird oft Protein oder Membran-Komplexen gebunden ist, hilft diese Erhöhung der Ausbeute der Replikation Fragmente, die wiederhergestellt werden.
- Die Proben werden dann durch Zugabe von 2 Volumen Phenol zu jeder Probe und die Rohre sind 5 Minuten lang vorsichtig invertiert extrahiert. Dann 2 Volumen Chloroform / Isoamylalkohol (24 / 1) zugegeben und die Röhrchen werden vorsichtig wieder für 5 Minuten umgedreht.
- Die Proben werden bei 14.000 rpm in einer Mikrozentrifuge für 5 Minuten und die obere wässrige Phase von jeder Probe zentrifugiert wird entfernt, und in ein frisches Röhrchen. Dann 4 Volumen Chloroform / Isoamylalkohol (24 / 1) zugegeben, die Rohre sind 5 Minuten lang vorsichtig invertiert und erneut zentrifugiert bei 14.000 rpm für 5 Minuten.
- Die obere, wässrige Phase in jeder Probe wird dann für 1 Stunde mit dem Spotting 100 &mgr; jeder Probe auf einem 47mm Whatman 0,025 um Pore Scheibe, die auf 250 ml 0,1 × TE schwimmt in einem Becherglas dialysiert. Da die Replikation Strukturen mit Einzelstrang Regionen oder Verzweigungspunkte anfälliger für Scheren sind wir in der Regel schneiden unsere Pipettenspitzen off mit einer Rasierklinge, um den Mund weiter und minimieren Scherkräfte. Im Allgemeinen sollte Pipettieren auf ein Minimum reduziert werden, bis nach dem DNA wurde mit Restriktionsenzymen verdaut worden.
- Jede Probe wird dann mit PvuII (New England Biolabs), die das Plasmid linearisiert nur hinter den Replikationsursprung verdaut.
- Vor dem Laden in das Agarosegel, 100 &mgr; Chloroform und 20 &mgr; l von 6X loading Farbstoff Bromphenolblau und Xylencyanol enthält, sind zu jeder Probe zugegeben und gemischt. Dann wird 40 ul der wässrigen Phase, welche die Be-Farbstoff in das Gel geladen. Zur Minimierung der strukturellen Verzerrungen, strukturelle Artefakte und DNA Scheren, macht diese Isolation Verfahren beinhalten keine Schritte, um für Einzelstrang Regionen, Niederschlag, oder konzentrieren sich die DNA-Proben nach Zell-Lyse zu bereichern.
3. 2D-Gel und Southern-Analyse.
- Die 2-dimensionalen Agarose-Gel-Analyse von 3 geändert. Für die 1. Dimension sind die eingeschränkten DNA-Proben durch ein 0,4% Agarosegel in 1x TBE bei 1V/cm laufen. Ein Liter 10x TBE-Stammlösung enthält:
- 108 g Tris Base
- 55 g Borsäure
- 40 ml 0,5 M EDTA (pH 8,0)
- Ein Lambda-Hind III Größenmarker in die erste Gasse geladen ist, dann Proben werden in jedem anderen Spur geladen. Wir starten üblicherweise die ersten dIMENSION ~ 12-15 Uhr. Skipping Gassen macht es einfacher, die Gassen Scheibe aus, um in die zweite Dimension gegossen. Die niedrige Spannung und geringe Prozent Agarosegel dient dazu, die DNA-Fragmente in erster Linie nach Größe aufgetrennt werden.
- Für die zweite Dimension, sind Gelspuren aus der ersten Dimension Gel mit einem großen Fleischermesser in Scheiben geschnitten. Die erste Spur mit dem Lambda-Hind III Marker kann mit Ethidiumbromid angefärbt werden. Mit dem Lambda-Hind III Marker als Leitfaden, zuschneiden und entsorgen Sie die Region des Gels, die unten ist, wo das linearisierte Plasmid erwartet zu laufen. Unter diesen Bedingungen finden wir, dass linearisierte pBR322 läuft leicht über dem Xylencyanol Fleck.
- Um warf die zweite Dimension ist jede Spur horizontal am oberen Rand eines leeren Gel Caster platziert. Eine Lösung von 1,0% Agarose in 1X TBE wird hergestellt und auf 55 ° C abgekühlt Zu diesem Zeitpunkt ist die Gel-Lösung in gegossen, um die zweite Dimension gegossen, so dass Sie vollständig abdecken Gelscheiben. Nachdem das Gel ausgehärtet ist, wird es bei 6.5V/cm in einer Elektrophorese-Einheit, dass der Puffer zu zirkulieren lässt laufen. Wir starten üblicherweise die zweite Dimension ~ 5,5-7 Stunden. Die hohe Spannung und hohe Prozent Agarosegel effektiv trennt die DNA-Fragmente nach ihrer Form basiert, wie auch die Größe. Nichtlineare Formen laufen langsamer durch die zweite Dimension.
- Nach der Elektrophorese wird das Gel wird dann in H 2 O gespült, zweimal in 400 ml 0,25 M Salzsäure für 15 Minuten, mit H 2 O gespült, und dann zweimal in 400 ml 0,4 M NaOH für 30 Minuten gewaschen. Die Säure wäscht dienen teilweise nick die DNA-Moleküle in kleinere Fragmente, die effizienter zu übertragen. Dieser Schritt ist notwendig aufgrund der Größe und ungewöhnlichen Formen der DNA-Replikation Zwischenprodukte.
- Die DNA in den Gelen wird dann auf eine Hybond N + Nylon übertragen Membran 4. Wir verwenden eine rückläufige Alkali-Transfer-System mit 0,4 M NaOH. Kurz gesagt, sind zwei Blätter Löschpapier in 0,4 M NaOH getränkt auf einem großen Stapel Papierhandtücher gelegt. Die Nylonmembran wird auch in 0,4 M NaOH getränkt und platziert auf der Oberseite des Löschpapier. Das Gel wird dann vorsichtig oben auf dieser geschichtet, gefolgt von einem weiteren Stück Löschpapier, in der NaOH-Lösung benetzt. Schließlich ist ein langes Stück angefeuchtet Löschpapier über den oberen Schichten und seinen beiden Enden in ein Geschirr mit 1 L 0,4 M NaOH-Lösung als Docht dienen platziert. Wir in der Regel lassen die DNA-Transfer für 6-12 Stunden.
- Die Nylonmembran wird entfernt, gewaschen 20-30 sec in 5X SSC-Puffer, und platziert in einer Hybridisierung Rolle Flasche mit 10.5ml Prähybridisierungslösung. Dann wird die Membran bei 42 ° C mit einer Rotation von mehr als 6 Stunden inkubiert. Prähybridisierungslösung:
- 5,0 ml Formamid
- 0,5 ml 20% SDS
- 2,5 ml 20X SSC *
- 2,0 ml 50X Denhardt *
- 0,5 ml Salmon Sperm DNA (10mg/ml)
* Rezepte für SSC und Denhardt kann in 5 gefunden werden
- Während der Prähybridisierung Zeit ist 1 pg Plasmid pBR322 mit 32P durch Nick-Translation nach dem Protokoll von Roche mit alpha bezeichnet [32-P]-dCTP geliefert gekennzeichnet. Die radioaktiv markierten Sonde (100 &mgr; l) wird durch Inkubation bei 98 ° C denaturiert für 10 Minuten in einem Schraubdeckel Mikrozentrifugenröhrchen, und dann sofort auf Eis gestellt.
- Die denaturierte Sonde wird auf 5,9 ml Hybridisierungslösung, die enthält, hinzugefügt:
- 3,0 ml Formamid
- 1,5 ml SSC
- 1,0 ml H 2 O
- 0,15 ml 50X Denhardt
- 0,10 ml 20% SDS
- 0,15 ml 10mg/ml Salmon Sperm DNA
- Die Prähybridisierungslösung ist aus der Rolle Flasche gegossen und die Hybridisierungslösung gegossen in. Die Walze Flasche wird dann an die 42 ° C Inkubator und gedreht von mehr als 12 Stunden zurück.
- Die Hybridisierungslösung wird der Walze Flasche gegossen. Dann wird der Blot 4-mal für 20 Minuten gewaschen in die Rolle Flasche mit ~ 150 ml einer Waschlösung mit 0.5X SSC, 0,1% SDS bei 42 ° C mit Rotation.
- Nach dem letzten Waschschritt wird die Membran auf ein Papiertuch gelegt, bis die Flüssigkeit sichtbar verschwunden ist. Die Membran wird dann in Polyvinylchlorid Plastikfolie gewickelt und ausgesetzt zu einem Phosporimager Bildschirm. Wir visualisieren und zu quantifizieren, die Radioaktivität mit einem Sturm 840 und die damit verbundenen ImageQuant Software.
4. Repräsentative Ergebnisse:
Abbildung 1. Plasmid-Replikation Zwischenprodukte bei der An-und Abwesenheit von UV-induzierten DNA-Schäden beobachtet. Die Migration Muster von PvuII verdaut pBR322 Plasmid durch 2D-Agarose-Gel-Analyse beobachtet wird grafisch dargestellt. Non-Replikation linearen Plasmide als lineare 4,4-kb-Fragment laufen. Replizierenden Plasmiden Form Y-förmige Strukturen, die langsamer als die nicht-replizierenden Fragmente aufgrund ihrer größeren Größe und keine Migrationnlinear Form. Diese Migration Muster bildet einen Bogen, der aus erstreckt sich von der linearen Bereich in Richtung des Brunnens. Nach UV-Bestrahlung, Doppel-Y-oder X-förmige Moleküle sind in der Kegel Region, die langsamer wandert als der Bogen der Y-förmige Moleküle beobachtet. Ein Beispiel für die Southern-Analyse der 2D-Gel sondiert mit 32P-markierten pBR322 ist für die Zellen unmittelbar nach UV-Bestrahlung und 15 Minuten nach UV-Bestrahlung (mit freundlicher Genehmigung des Verlags) gezeigt.
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Discussion
Typische Ergebnisse aus Wildtyp-Zellen in Anwesenheit und Abwesenheit von UV-induzierten Schäden sind in Abbildung 1 dargestellt. In Abwesenheit von Schäden, kann ~ 1% der gesamten Plasmid-DNA in der Y-Bogen gefunden werden, wenn die Zellen rasch wachsende in der exponentiellen Phase. Nach der Bestrahlung ist ein vorübergehender Anstieg der Y-förmige Moleküle beobachtet, wie blockiert Replikationsgabeln an geschädigten Stellen ansammeln. Die X-förmige Replikation Zwischenprodukte auch vorübergehend ansammeln und bis zu einer Zeit, die mit, wenn die Läsionen sind repariert korreliert bestehen.
An die Stelle der Southern-Analyse kann die Replikation Zwischenprodukte aus dem Gel gestanzt werden mit einem Kunststoff-Trinkhalm, gereinigt und direkt beobachtet mittels Elektronenmikroskopie. Wir haben diesen Ansatz erfolgreich zu Genprodukte erforderlich Replikationsgabeln, dass DNA-Schäden zu begegnen und abnorme Replikation Zwischenprodukte, die in diesen Mutanten akkumulieren identifizieren Prozess zu identifizieren. Darüber hinaus kann dieser Ansatz leicht modifiziert werden, um andere Formen von DNA-Schäden zu untersuchen.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Die Arbeit in unserem Labor wird von CAREER-Preis MCB0551798 von der National Science Foundation und AREA gewähren R15GM86839 aus dem NIGMS-NIH unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| An example of the Southern analysis of the 2D gel probed | GE Healthcare | G15T8 | Yellow Lighting |
| 15 μwatt germicidal lamp | Sylvania | F20T12/GO | UV Lamp |
| Blak-Ray UV Intensity Meter 254nm | Daigger | EF28195T | UVC photometer |
| 0.025 μm pore disks | Whatman, GE Healthcare | VSWP04700 | Floating dialysis disks |
| PvuII | Fermentas | ER0632 | Restriction Endonuclease |
| Nick-translation kit | Roche Group | 976776 | To make 32P-labeled probe |
| Blotting Paper | Whatman, GE Healthcare | 3030-704 | For Southern transfer |
| Nylon membrane | GE Healthcare | RPN203S | For Southern transfer |
References
- Davis, B. D. The Isolation of Biochemically Deficient Mutants of Bacteria by Means of Penicillin. Proc Natl Acad Sci U S A. 35, 1-10 (1949).
- Courcelle, J., Donaldson, J. R., Chow, K. H., Courcelle, C. T. DNA Damage-Induced Replication Fork Regression and Processing in Escherichia coli. Science. 299, 1064-1067 (2003).
- Friedman, K. L., Brewer, B. J. Analysis of replication intermediates by two-dimensional agarose gel electrophoresis. Methods Enzymol. 262, 613-627 (1995).
- Spivak, G., Hanawalt, P. C. Determination of damage and repair in specific DNA sequences. METHODS: A Companion to Methods in Enzymology. 7, 147-161 (1995).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning - A laboratory manual. , CSHL Press. Cold Spring Harbor. (2001).
- Donaldson, J. R., Courcelle, C. T., Courcelle, J. RuvABC is required to resolve holliday junctions that accumulate following replication on damaged templates in Escherichia coli. J Biol Chem. 281, 28811-28821 (2006).
- Donaldson, J. R., Courcelle, C. T., Courcelle, J. RuvAB and RecG Are Not Essential for the Recovery of DNA Synthesis Following UV-Induced DNA Damage in Escherichia coli. Genetics. 166, 1631-1640 (2004).
- Chow, K. H., Courcelle, J. RecO Acts with RecF and RecR to Protect and Maintain Replication Forks Blocked by UV-induced DNA Damage in Escherichia coli. J Biol Chem. 279, 3492-3496 (2004).
- Belle, J. J., Casey, A., Courcelle, C. T., Courcelle, J. Inactivation of the DnaB helicase leads to the collapse and degradation of the replication fork: a comparison to UV-induced arrest. J Bacteriol. 189, 5452-5462 (2007).
- Chow, K. H., Courcelle, J. RecBCD and RecJ/RecQ initiate DNA degradation on distinct substrates in UV-irradiated Escherichia coli. Radiat Res. 168, 499-506 (2007).
- Al-Hadid, Q., Ona, K., Courcelle, C. T., Courcelle, J. RecA433 cells are defective in recF-mediated processing of disrupted replication forks but retain recBCD-mediated functions. Mutat Res. 645, 19-26 (2008).
