Summary
Biz, iki boyutlu agaroz-jel analizi, UV ışını meydana çoğaltma ara yapısını tanımlamak için kullanılır olabilir bir prosedür sunuyoruz.
Abstract
DNA hasarı varlığı Yanlış çoğaltma ve yaygın olarak insanlarda kanser gelişimi ile doğrudan ilişkili olduğuna inanılan tüm hücre tiplerinde gözlenen hücresel düzenlenmeleri ve mutagenez çoğunluk için sorumludur. DNA hasarı, UV ışını ile indüklenen gibi ciddi doğru genomik şablonu çoğaltmak çoğaltma yeteneğini bozar. Bir dizi gen ürünleri çoğaltma şablon DNA lezyonlar karşılaştığında gerekli olduğu tespit edilmiştir. Ancak, kalan meydan çoğaltma sırasında bu proteinlerin nasıl süreci lezyonları belirlemek olmuştur
Protocol
1. Büyüme ve UV Işınlama.
- Şekeri% 0.4,% 0.2 casamino asitler, ve 10 mg / ml timin (DGCthy orta) ve 100 mg / ml ampisilin ile desteklenmiş Davis orta 1 yetiştirilen plazmid pBR322 içeren taze bir gece kültür 200μl pelet. Hücre pelletini sonra ampisilin eksik 200μl DGCthy orta yeniden bekletildi ve 20 ml DGCthy orta aşılamak için kullanılır.
- Kültürler 0.5 OD 600 (~ 5 x 10 8 hücre / ml) 37 sallayarak inkübatör ampisilin seçimi ° C olmadan yetiştirilmektedir. Büyüme ampisilin olmadan bazı mutantlar ortaya çıkabilecek anormal veya verimsiz çoğaltma ara karşı seçimi önler. Hasara neden UV ışık kullanıyorsanız, UV etkili doz azaltılması, bu dalga boylarında ve kalkanlar hücreleri güçlü emer çünkü ek olarak, medya ampisilin çıkarılması gereklidir.
- Sarı ışıklar altında çalışan, kültür, ajitasyon için dönen bir platform üzerinde 15 cm çaplı Petri kabı yerleştirilir. Bizim kültür UVC fotometre ile ölçülür ~ 1 J/m2/sec, bir maruz kalma oranı üreten bir antiseptik lamba 15 watt bir mesafede yerleştirilir. Kültürler 50 J/m2 ışınlanmış ve ardından hemen arkasına yerleştirilen deney süresi boyunca 37 ° C inkübatör sallayarak. Bu doz, ortalama 1 Siklobütanın pirimidin dimer ssDNA her 4,5 kb, üretir. Sarı ışık fotolizaz Siklobütanın pirimidin dimerleri photoreactivation-ters önler.
2. DNA İzolasyonu.
- Çoğaltma ara incelenmesi gereken zamanlarda, kültür 0.75 ml kısım 0.75 ml buz gibi NET30 Buffer (100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 8.0, 30 mM EDTA) içine yerleştirilir ve sonuna kadar buz üzerinde yerleştirilen zaman elbette. Genellikle 0 ile incelenen örneklerin, 15, 30, 45, 60 ve 90 dakika ile 90 dakikalık bir zaman ders çalıştırmak. EDTA ve soğuk etkili çoğaltma ve nükleotid eksizyon onarımı durdurmak için hizmet vermektedir.
- Her bir örnek, 1.5 mg / ml lizozim ve TE 0.2 mg / ml RNaseA (10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA) 150 ul yeniden süspanse ve 20 dakika 37 ° C parçalanmış, sonra pelet. Şu anda, 20% sarkosyl proteinaz K (10mg/ml) ve 10μl 10μl eklenir ve inkübasyon 1 saat süreyle devam etmesine izin. Proteinaz K ve sarkosyl fenol ekstraksiyonu oluşmadan önce veya membran proteinleri ile ilişkili olabilir DNA parçalarının serbest bırakmak için yardımcı olur. Aktif kopyalayan DNA genellikle protein veya membran komplekslere bağlı olduğundan, bu kurtarıldı çoğaltma parçaları verimi artırmaya yardımcı olur.
- Örnekler daha sonra her bir örnek için fenol 2 hacim ekleme ve tüpler 5 dakika hafifçe ters tarafından ayıklanır. Sonra 2 hacim kloroform / izoamil alkol (24 / 1) eklenir ve tüpler 5 dakika boyunca yavaşça tekrar ters.
- Örnekleri, 5 dakika ve her numunenin üst sulu faz için bir mikrosantrifüj 14.000 rpm'de santrifüj kaldırılır ve yeni bir tüp yerleştirilir. Sonra kloroform / izoamil alkol (24 / 1) 4 cilt, eklenir tüpler 5 dakika hafifçe ters ve yine 5 dakika 14.000 rpm'de santrifüj.
- Her numune üst, sulu faz sonra 1 saat süreyle bir beher 0.1x TE 250 ml üzerinde yüzen bir 47mm whatman 0.025 mikron gözenek diske her numunenin 100μl lekelenme diyalize. Tek iplikli bölgeler veya şube noktaları ile kopyalayan yapılar kesme daha duyarlı olduğundan, biz genellikle ağız geniş ve kesme güçleri en aza indirmek için bir jilet ile pipet uçları kesilir. Genel olarak, pipetleme DNA restriksiyon enzimleri ile sindirilir edildikten sonra kadar minimumda tutulması olmalıdır.
- Her bir örnek daha sonra çoğaltma kökeni sadece mansap plazmid linearizes PvuII (New England Biolabs) ile sindirilir.
- Agaroz jel, 100μl kloroform ve Bromophenol Mavi ve Ksilen Cyanol içeren 6X yükleme boya 20μl yüklemeden önce her bir örnek eklenir ve karıştırılır. Daha sonra, yükleme boya içeren sulu faz 40μl jel içine yüklenir. Yapısal önyargıları, yapısal eserler, ve DNA kesme en aza indirmek için, bu izolasyon prosedürü hücre parçalama tek iplikli bölgelerde, çökelti, ya da DNA örnekleri konsantre zenginleştirmek için herhangi bir adım içermez.
3. 2D Jel ve Güney Analizi.
- 2-boyutlu agaroz-jel analizi 3 ila güncellenmiştir. 1. boyut için kısıtlı DNA örnekleri 1V/cm 1X TBE% 0.4 agaroz jel ile çalıştırılır. 10X TBE stok solüsyonu Bir Litre içerir:
- 108 g Tris Base
- 55 gr Borik Asit
- 40 ml 0,5 M EDTA (pH 8.0)
- Lambda Hind III boyut işareti ilk şeritte yüklenir, daha sonra örnekleri diğer her kulvarda yüklenir. Biz genellikle ilk d çalıştırmakimension ~ 12-15 saat. Şeritleri Atlama, daha kolay şerit ikinci boyutta döküm dilim hale getirir. Düşük voltaj ve düşük yüzde agaroz jel öncelikle boyutu dayalı DNA parçalarının ayrı hizmet vermektedir.
- Ikinci boyut için büyük bir kasap bıçağı ile ilk boyut jel, jel şeritleri dışında dilimlenmiş. Lambda Hind III işaretleyici içeren ilk şeritli ethidium bromid ile boyandı. Bir kılavuz, ürün olarak lambda Hind III kalem kullanarak ve Lineerleştirilmiş plazmid sürmesi bekleniyor nerede aşağıda jel bölgedeki atın. Bu koşullar altında, biz bu lineerleştirilmiş pBR322 biraz ksilen cyanol leke yukarıdaki çalışır.
- Ikinci boyut döküm için, her şeritli boş bir jel tekerin üstüne yatay olarak yerleştirilir. 1X TBE% 1.0 agaroz çözeltisi 55 ° C'ye kadar hazırlanır ve soğutulur Şu anda, jel solüsyon, jel dilim tamamen karşılamak için emin olun, ikinci boyut döküm dökülür. Sonra jel seti, tampon sirküle sağlayan bir elektroforez biriminde 6.5V/cm çalıştırmak. Biz genellikle ikinci boyut ~ 5,5-7 saat çalıştırın. Yüksek gerilim ve yüksek yüzde agaroz jel şekline göre DNA parçalarının yanı sıra, boyutu etkin bir şekilde ayırır. Doğrusal olmayan şekiller ikinci boyut daha yavaş çalışır.
- Ardından elektroforez, jel sonra H 2 O durulanır, H 2 O ile durulanır 15 dakika, 0.25m hidroklorik asit 400ml iki kere yıkanır, ve sonra iki kez 30 dakika süreyle 400 ml 0.4M NaOH yıkanır . Asit DNA molekülleri hizmet daha verimli bir şekilde aktarma küçük parçalara kısmen nick yıkar. Bu adım, büyüklüğü ve DNA replikasyonu ara alışılmadık şekillere nedeniyle gereklidir.
- Jeller DNA sonra bir Hybond N + naylon membran 4. Biz 0.4M NaOH ile alkali aşağı yönlü bir transfer sistemi kullanır. Kısaca, iki sayfa 0.4M NaOH batırılmış kağıt blot büyük bir yığın kağıt havlu üzerine yerleştirilir. Naylon membran 0.4M NaOH batırılmış ve blot kağıt üstüne yerleştirilir. Sonra jel dikkatle NaOH çözeltisi ıslatılmış başka bir parça kurutma kağıdı takip Bunun üstüne katmanlı. Son olarak, uzun bir parça ıslak blot kağıt üst kısmında katmanlı ve iki ucu, 1 L bir fitil olarak hizmet 0.4M NaOH çözeltisi içeren bir yemekleri yerleştirilir. Biz genellikle 6-12 saat için DNA transferi sağlar.
- Naylon zarı kaldırılır, 5X SSC Tampon 20-30 sn yıkanmış ve 10.5ml Prehybridization Çözüm içeren bir melezleşme silindir şişede yerleştirilir. Sonra, membran 42 ° C rotasyon ile fazla 6 saat inkübe edilir. Prehybridization çözüm:
- 5.0 ml formamid
- 0.5 ml% 20 SDS
- 2.5 ml 20X SSC *
- 2.0 ml 50X Denhardt *
- 0.5 ml Somon Sperm DNA (10mg/ml)
* SSC ve Denhardt için yemek tarifleri 5 bulunabilir
- Plazmid pBR322 prehybridization dönemde, 1 mg [32-P]-dCTP etiketli kullanarak alfa Roche tarafından verilen protokole göre nick çeviri 32P ile etiketlenir. Radyoaktif prob (100μl), 98 inkübe tarafından denatüre ° C, daha sonra bir vidalı kapak mikrosantrifüj tüp içinde 10 dakika boyunca ve buz üzerinde hemen önüne yerleştirilmelidir.
- Denatüre prob içeren 5.9 ml hibridizasyon çözüm eklenir:
- 3.0 ml formamid
- 1.5 ml SSC
- 1.0 ml H 2 O
- 0.15 ml 50X Denhardt
- 0.10 ml% 20 SDS
- 0.15 ml 10mg/ml Somon Sperm DNA
- Prehybridization çözüm silindir şişe dışarı dökülür ve hibridizasyon çözümü silindir şişe sonra 12hrs daha fazla 42 ° C inkübatör ve döndürülmüş iade edilir dökülür.
- Hibridizasyon çözüm silindir şişe dışarı dökülür. Sonra, leke silindir rotasyon ile 0.5x SSC,% 0.1 SDS 42 ° C yıkama solüsyonu içeren bir ~ 150 ml şişe içinde 20 dakika 4 kez yıkanır.
- Kadar sıvı gözle görülür bir şekilde ortadan kayboldu son yıkama sonrasında, membran bir kağıt havlu üzerine yerleştirilir. Membran sonra polivinil klorür plastik şal sarılmış ve bir phosphorimager ekrana maruz kalmaktadır. Fırtına 840 ve ilişkili ImageQuant Yazılım kullanarak radyoaktivite görselleştirmek ve kantitatif.
4. Temsilcisi Sonuçlar:
Şekil 1. Plazmid çoğaltma ara UV ışınlarına bağlı DNA hasarı varlığı ve yokluğu gözlenen PvuII göç desen 2D-agaroz-jel analizi ile gözlenen plazmid pBR322 sindirilir diyagramı. Sigara kopyalayan doğrusal plazmid 4.4-kb doğrusal bir parçası olarak çalıştırın. Çoğaltılıyor plazmid, onların daha büyük boyutuna bağlı olmayan kopyalayan parçaları daha yavaş ve göç Y-şekilli yapılar formunlinear şekli. Bu göç desen doğrusal bölgede iyi doğru uzanan bir yay oluşturur. UV ışınlama, çift-Y ya da X-biçimli molekülleri, yay Y-şekilli moleküllerin daha yavaş göç koni bölgede görülmektedir. 2D jel Güney analizi bir örnek 32P-etiketli pBR322 probed UV ışını ve 15 dakika UV ışını (Yayıncının izni ile çoğaltılabilir) sonra hemen sonra hücreler için gösterilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
UV hasarına varlığı ve yokluğu vahşi tip hücreler elde edilen tipik sonuçlar Şekil 1'de gösterilmiştir. Hasar yokluğunda, hücreler üstel fazda hızla büyüyor ~% 1, toplam plazmid DNA Y ark. Bloke çoğaltma çatal hasarlı siteleri biriktikçe ışınlama takiben, Y şekilli moleküllerin geçici bir artış görülmektedir. X-şeklinde çoğaltma ara lezyonlar tamir ile ilişkilendiren bir saatine kadar geçici olarak birikir ve devam.
Güney analizi yerine, çoğaltma ara, saflaştırılmış bir plastik içme saman jel delikli olabilir ve elektron mikroskobu ile doğrudan gözlemlemiştir. DNA hasarı ile karşılaşmakta ve bu mutantlar birikir anormal çoğaltma ara tanımlamak için çoğaltma çatal işlemek için gerekli gen ürünleri tanımlamak için bu yaklaşımı başarıyla kullanmıştır. Buna ek olarak, bu yaklaşım, DNA hasarı diğer formları incelemek için kolayca değiştirilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Laboratuarımızda NIGMS-Ulusal Sağlık Enstitüsü, Ulusal Bilim Vakfı ve ALANI hibe R15GM86839 KARİYER ödül MCB0551798 tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| An example of the Southern analysis of the 2D gel probed | GE Healthcare | G15T8 | Yellow Lighting |
| 15 μwatt germicidal lamp | Sylvania | F20T12/GO | UV Lamp |
| Blak-Ray UV Intensity Meter 254nm | Daigger | EF28195T | UVC photometer |
| 0.025 μm pore disks | Whatman, GE Healthcare | VSWP04700 | Floating dialysis disks |
| PvuII | Fermentas | ER0632 | Restriction Endonuclease |
| Nick-translation kit | Roche Group | 976776 | To make 32P-labeled probe |
| Blotting Paper | Whatman, GE Healthcare | 3030-704 | For Southern transfer |
| Nylon membrane | GE Healthcare | RPN203S | For Southern transfer |
References
- Davis, B. D. The Isolation of Biochemically Deficient Mutants of Bacteria by Means of Penicillin. Proc Natl Acad Sci U S A. 35, 1-10 (1949).
- Courcelle, J., Donaldson, J. R., Chow, K. H., Courcelle, C. T. DNA Damage-Induced Replication Fork Regression and Processing in Escherichia coli. Science. 299, 1064-1067 (2003).
- Friedman, K. L., Brewer, B. J. Analysis of replication intermediates by two-dimensional agarose gel electrophoresis. Methods Enzymol. 262, 613-627 (1995).
- Spivak, G., Hanawalt, P. C. Determination of damage and repair in specific DNA sequences. METHODS: A Companion to Methods in Enzymology. 7, 147-161 (1995).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning - A laboratory manual. , CSHL Press. Cold Spring Harbor. (2001).
- Donaldson, J. R., Courcelle, C. T., Courcelle, J. RuvABC is required to resolve holliday junctions that accumulate following replication on damaged templates in Escherichia coli. J Biol Chem. 281, 28811-28821 (2006).
- Donaldson, J. R., Courcelle, C. T., Courcelle, J. RuvAB and RecG Are Not Essential for the Recovery of DNA Synthesis Following UV-Induced DNA Damage in Escherichia coli. Genetics. 166, 1631-1640 (2004).
- Chow, K. H., Courcelle, J. RecO Acts with RecF and RecR to Protect and Maintain Replication Forks Blocked by UV-induced DNA Damage in Escherichia coli. J Biol Chem. 279, 3492-3496 (2004).
- Belle, J. J., Casey, A., Courcelle, C. T., Courcelle, J. Inactivation of the DnaB helicase leads to the collapse and degradation of the replication fork: a comparison to UV-induced arrest. J Bacteriol. 189, 5452-5462 (2007).
- Chow, K. H., Courcelle, J. RecBCD and RecJ/RecQ initiate DNA degradation on distinct substrates in UV-irradiated Escherichia coli. Radiat Res. 168, 499-506 (2007).
- Al-Hadid, Q., Ona, K., Courcelle, C. T., Courcelle, J. RecA433 cells are defective in recF-mediated processing of disrupted replication forks but retain recBCD-mediated functions. Mutat Res. 645, 19-26 (2008).
