Transecção do nervo óptico é um modelo amplamente utilizado de lesão do SNC adulto. Este modelo é ideal para a realização de uma série de manipulações experimentais que visam a retina globalmente ou diretamente a população-alvo feridos neuronal de células ganglionares da retina.
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Artigo de método
Métodos para manipulações experimentais após a transecção do nervo óptico no sistema nervoso central de mamíferos
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Neste artigo
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Resumo
Resumo
Células ganglionares da retina (RGCs) são neurônios do SNC que a informação de saída visual da retina para o cérebro, através do nervo óptico. O nervo óptico pode ser acessado dentro da órbita do olho e completamente seccionado (axotomized), cortando os axônios de toda a população RGC. Transecção do nervo óptico é um modelo reprodutível de morte celular por apoptose neuronal no SNC adulto 1-4. Este modelo é particularmente atraente porque a câmara vítrea do olho funciona como uma cápsula para entrega de drogas para a retina, permitindo manipulações experimentais através de injeções intra-ocular. A difusão de substâncias químicas através do fluido vítreo garante que eles agem sobre toda a população RGC. Vetores virais, plasmídeos ou curto RNAs de interferência (siRNAs) também pode ser entregue à câmara vítrea, a fim de infectar ou transfecção as células da retina 12/05. O tropismo elevado de vírus adeno-associado (AAV) vetores é benéfico para RGCs alvo, com uma taxa de infecção de aproximadamente 90% de células perto do local da injeção 6, 7, 13-15. Além disso, RGCs pode ser seletivamente transfectadas aplicando siRNAs, plasmídeos ou vetores virais para o fim do corte do nervo óptico 16-19 ou vetores injetar seu alvo o colículo superior 10. Isso permite que os pesquisadores a estudar mecanismos apoptóticos na população neuronal feridos sem efeitos de confusão sobre os neurônios ou células gliais bystander outras circunvizinhas. RGC apoptose tem uma característica de tempo-curso em que a morte da célula é retardado postaxotomy 3-4 dias, após o qual as células degeneram rapidamente. Isso proporciona uma janela para manipulações experimentais contra processos envolvidos na apoptose. Manipulações que visam directamente o RGCs do tronco do nervo óptico transeccionados são realizadas no momento da axotomia, imediatamente após o corte do nervo. Em contraste, quando as substâncias são entregues via uma rota intra-ocular, que pode ser injetado antes da cirurgia ou durante os primeiros três dias após a cirurgia, que precede o início da apoptose em RGCs axotomized. No presente artigo, demonstramos vários métodos para manipulações experimentais após a transecção do nervo óptico.
Protocolo
1. Técnica Cirúrgica
- Experimentos devem ser realizados com técnica asséptica e seguindo os protocolos de uso de animais de sua instituição específica. Instrumentos e materiais (soluções, as substâncias, marcadores, agulhas, etc) entrem em contacto com tecidos vivos, deve ser esterilizado para evitar infecções e impactos negativos no bem-estar animal e os potenciais impactos negativos sobre o estudo.
2. Anestesia
- Ratos serão anestesiados utilizando um sistema vaporizador veterinária isoflurano. Uso de oxigênio classe médica a uma taxa de 0,8 L / min para vaporizar o gás isoflurano. Colocar o animal na caixa de a....
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Discussão
Transecção do nervo óptico é um modelo altamente reprodutível de apoptose adulto CNS neurônio. As manipulações experimentais demonstraram neste manuscrito permitir o estudo dos mecanismos da apoptose RGC após a lesão.
Injeções intra-oculares são úteis para o direcionamento global da retina. Este procedimento requer alguma prática, pois é fundamental para não ferir a lente com a ponta da pipeta de vidro. Danos lente foi mostrado para causar a liberação de fatores de crescimento, alterando a s.......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
PDK é suportado por uma operação CIHR subvenção (MOP 86,523)
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Quadro Estereotáxico | Stoelting Co. | ||
| Máscara de Gás para Ratos | Stoelting Co. | ||
| Sistema de Anestesia | VetEquip | 901806 | |
| Isoflurano (PrAErrane) | Baxter Internationl Inc. | DIN 02225875 | |
| Microscópio Cirúrgico | WPI, Zeiss, Leica | ||
| Colírio Alcaine | Alcon | ||
| Lágrimas Naturale P.M. | Alcon | ||
| Pinceta de Ponta Fina Dumont | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Seringa Hamilton de 10 μl (1701RN; 26s/2”/2) | Hamilton Co | 80030 | |
| Conectores de Compressão de 1/16 de polegada | Hamilton Co | 55751-01 | |
| Tubo PEEK com Diâmetro Externo de 1/16 de polegada e Diâmetro Interno de 0,010 polegadas | Supelco, Sigma-Aldrich | Z226661 | |
| Coplador de Vidro RN Duplo | Hamilton Co | 55752-01 | |
| Kit de Escorva com Óleo Mineral: inclui seringa, agulhas e septos de borracha | Hamilton Co | PRMKIT |
Referências
- Bahr, M. Live or let die - retinal ganglion cell death and survival during development and in the lesioned adult CNS. Trends Neurosci. 23, 483-4890 (2000).
- Isenmann, S., Kretz, A., Cellerino, A. Molecular deter....
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Reimpressões e permissões
Errata
Formal Correction: Erratum: Methods for Experimental Manipulations after Optic Nerve Transection in the Mammalian CNS
Posted by JoVE Editors on 5/31/2011. Citeable Link.
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