Imprinting é um fenômeno em plantas e da reprodução de mamíferos. Metilação do DNA desempenha um papel importante nos mecanismos de imprinting. Isolando endosperma e determinação do estatuto de metilação de genes imprinted em Arabidopsis Pode ser difícil. Neste protocolo, descrevemos como isolar endosperma e determinar a metilação por seqüenciamento bissulfito.
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Artigo de método
Determinação de metilação de DNA de genes marcados em Arabidopsis Endosperma
Neste artigo
Resumo
Resumo
Arabidopsis thaliana é um organismo excelente modelo para estudar mecanismos epigenéticos. Uma das razões é o mutante nulo de perda de função de DNA metiltransferases é viável, proporcionando assim um sistema para estudar como a perda da metilação do DNA em um genoma afeta o crescimento e desenvolvimento. Imprinting refere-se a expressão diferencial dos alelos maternos e paternos e desempenha um papel importante no desenvolvimento da reprodução em ambos os mamíferos e plantas. Metilação do DNA é fundamental para determinar se os alelos maternos ou paternos de um gene é expresso impressa ou silenciados. Em plantas com flores, há um evento de fertilização dupla na reprodução: um espermatozóide fertiliza o óvulo para formar um embrião e esperma fusíveis segundo com a célula central para dar origem a endosperma. Endosperma é o tecido onde imprinting ocorre nas plantas. MEDEA, a SET domínio gene grupo Polycomb e FWA, um fator de transcrição que regulam a floração, são os dois primeiros genes mostrado para ser impressa no endosperma e sua expressão é controlada por metilação do DNA e desmetilação em plantas. , A fim de determinar o status de impressão de um gene e padrão de metilação no endosperma, precisamos ser capazes de isolar endosperma primeiro. Desde que a semente é pequena em Arabidopsis, ele continua sendo um desafio para isolar endosperma Arabidopsis e examinar a sua metilação. Neste protocolo de vídeo, relatamos como conduzir um cruzamento genético, para isolar o tecido de endosperma de sementes, e para determinar o estado de metilação de seqüenciamento bissulfito.
Protocolo
I. Genética Travessia
1. Castrar o pai do sexo feminino
A fim de distinguir os alelos maternos e paternos, usando polimorfismo de DNA seqüência, dois ecótipos diferentes, por exemplo, Columbia-0 (Col-0) e Ler, serão escolhidos como pais feminino e masculino. As plantas devem ser jovens e saudáveis. Pode-se castrar o pai do sexo feminino, usando um microscópio de dissecação, ampliando viseira, ou olho nu. Localize estágio-12 flores (Smyth et al., 1990) e remover qualquer flores ou siliques acima e abaixo deles pelo recorte da base do pedicelo com a tesoura. Esterilizar fórceps por imersão a base da ponta su....
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Discussão
É relativamente fácil separar embrião do endosperma e tegumento, mas é entediante para separar endosperma de tegumento, especialmente para sementes na fase inicial ou média torpedo da embriogênese. Desde tegumento contribui apenas com uma pequena quantidade de tecido, para alguns genes, por exemplo, MEA e FWA, não temos para separar endosperma de tegumento. Isso significa que podemos isolar RNAs de uma mistura de endosperma e tecidos tegumento, verificar a expressão dos alelos maternos e paternos de um.......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Os autores agradecem a Sra. Jennifer M. Lommel e Tara N. Rognan para a manutenção de plantas de Arabidopsis. Este trabalho foi financiado por fundos start-up de Saint Louis University e dos Institutos Nacionais de Saúde concede 1R15GM086846-01 e 3R15GM086846-01S1 para W. Xiao.
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Materiais
Abastecimento
- Microscópio de dissecação
- Tesoura
- Pinça Ponta Fina
- Tag da jóia
- Estacas de plantas
- Barbante ou fios de arame
- 4 "X 2" X 8 "sacos de polietileno
- 3 "X 1" X 1,0 milímetros Lâminas de microscopia
- Nitrogênio líquido
- Recipientes de azoto líquido
- Bloco de calor
- PCR Tubes
- Termociclador
- Tubos de microcentrífuga
- Microcentrífuga
- Instalação de eletroforese em gel
- Arabidopsis thaliana Columbia-0 Plantas
- Arabidopsis thaliana Landsberg Plantas erecta
Reagentes
- Etanol 70%
- Etanol 95%
- O etanol 100%
- 0,3 M de sorbitol e 5 mM MES-pH 5,7
- Brometo de amônio cetiltrimetilamônio (CTAB)
- O etanol 100%
- Cholorform
- Enzimas de Restrição
- 3 M NaOH
- 6,3 M NaOH
- 6,24 M de uréia / 4 bissulfito de sódio M
- Destilada estéril H 2 O
- 10 mM hidroquinona
- Assistente de DNA Sistema Clean-Up (Promega)
- 10 M NH 4 OAc
- 20 mcg / mL tRNA
- Tampão TE
- O TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen)
Referências
- Clark, S. J., Harrison, J., Paul, C. L., Frommer, M. High sensitivity mapping of methylated cytosines. Nucleic Acids Res. 22, 2990-2997 (1994).
- Cokus, S. J., Feng, S., Zhang, X., Chen, Z., Merriman, B., Haudenschild, C. D., Sriharsa Pradhan, S., Nelson, S. F., Pellegrini, M., Jacobsen, S. E.
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Reimpressões e permissões
