Um protocolo para isolar e ativando espermátides de macho C. elegans É descrito aqui. Cortar a extremidade posterior de espermátides macho libera. O espermátides pode ser ativado por adição de protease.
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Artigo de método
Isolamento e In vitro A ativação do Caenorhabditis elegans Sperm
Neste artigo
Resumo
Resumo
Machos e hermafroditas são as duas formas encontradas naturalmente sexual na nemátodo C. elegans. Os espermatozóides amebóides são produzidos por machos e hermafroditas. Na fase anterior do gametogênese, as células germinativas dos hermafroditas diferenciar em número limitado de espermatozóides - cerca de 300 - e são armazenados em um "saco" pequena chamada espermateca. Mais tarde, os hermafroditas produzem continuamente oócitos 1. Em contraste, os homens produzem espermatozóides durante toda a sua exclusiva idade adulta. Os machos produzem espermatozóides tanto que representa> 50% do total de células em um 2 adulto típico worm. Portanto, isolar os espermatozóides dos machos é mais fácil do que da de hermafroditas.
Apenas uma pequena proporção dos machos são naturalmente gerados devido à espontânea de não-disjunção do cromossomo X 3. Cruzamento com os machos hermafroditas ou mais convenientemente, a introdução de mutações a dar origem a Ele (alta incidência de machos) fenótipo são algumas das estratégias através das quais pode-se enriquecer a população masculina 3.
Os machos podem ser facilmente distinguidos dos hermafroditas, observando os 4 morfologia da cauda. Cauda hermafrodita é apontado, ao passo que no sexo masculino é de cauda arredondada com estruturas de acasalamento.
Corte a cauda libera grande número de espermátides armazenada dentro do trato reprodutivo masculino. Dissecção é realizada sob um microscópio estéreo com 27 agulhas. Desde espermátides não estão fisicamente conectados com quaisquer outras células, a pressão hidráulica expele o conteúdo interno do corpo masculino, incluindo espermátides 2.
Os machos são diretamente dissecado em uma pequena gota de 'Medium esperma'. Espermátides são sensíveis a alteração no pH. Assim, HEPES, um composto com boa capacidade de tamponamento é utilizada nos meios de comunicação de esperma. Glicose e outros sais presentes na mídia esperma ajudar a manter a pressão osmótica para manter a integridade dos espermatozóides.
Pós-meiótica diferenciação de espermátides em espermatozóides é denominado espermiogênese ou ativação de esperma. Shakes 5, 6 e Nelson anteriormente mostrou que espermátides arredondadas podem ser induzidas a se diferenciarem em espermatozóides pela adição de compostos de ativar diversos, incluindo pronase E. Aqui demonstramos in vitro espermiogênese de C. espermátides elegans utilizando pronase E.
Espermiogênese de sucesso é pré-requisito para a fertilidade e, portanto, os mutantes defeituosos em espermiogênese são estéreis. Até então vários mutantes foram mostrados para ser defeituoso, especificamente no processo de espermiogênese 7. Anormalidade encontrada durante a ativação in vitro de romance Spe (Espermatogênese defeituoso) mutantes iria nos ajudar a descobrir jogadores adicionais participar neste evento.
Protocolo
1) O enriquecimento da população masculina
- Dependendo da necessidade experimental, um grande número de homens pode ser obtida através do emprego de uma das seguintes estratégias:
- grande população de machos do tipo selvagem pode ser obtida através do cruzamento 5 machos tipo selvagem e um hermafrodita em um gramado pequeno de OP50 semeado no centro da placa NGM. Cerca de 50% da geração seguinte será do sexo masculino do tipo selvagem.
- ele-5 (e1490) ou ele-8 (e1489) hermafroditas jogar grande número de machos.-lo-5-8 e ele os machos são férteis e não há nenhum defeito óbvio na morfologia espermática e fu....
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Discussão
Além de analisar os mutantes Spe, este protocolo tem outras aplicações importantes, tais como analisar a morfologia espermática com o envelhecimento. Espermátides e espermatozóides isolados usando este protocolo pode ser usado em outras experiências, como a jusante, imunocoloração do tipo selvagem e mutante de esperma 8, 9, motilidade do esperma em lâminas de 10, medidas fisiológicas 9, 11, ou até mesmo a inseminação artificial 12.
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Agradecemos a Samuel Ward, Diane C. Shakes e Gregory Nelson de pioneiro dessa técnica. Agradecemos a Pavan Kadandale e Brian Geldziler para vídeos mostrando espermatozóides ativados; membros do laboratório Singson para discussões úteis; CGC para as estirpes e NIH para apoiar-nos através de subvenção (R01HD054681).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Seringa tuberculínica | BD Biosciences | 309623 | Seringa: 1 ml, agulha: 27G X ½ in |
| Caneta Pap | Zymed Laboratories, Inc. | 00-8888 | |
| Lâminas microscópicas VWR VistaVision HistoBond | VWR international | 16004-406 | Dimensão: 75X25X1mm |
| Lâmina de cobertura | VWR international | 48366045 | |
| Protease | Sigma-Aldrich | P-6911 |
Referências
- Kimble, J., Crittenden, S. L. Controls of germline stem cells, entry into meiosis, and the Sperm/Oocyte decision in Caenorhabditis elegans. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 23, 405-433 (2007).
- Lhernault, S. W., Roberts, T. M. Methods ....
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