Monitoramento células imunes Tráfico Rods Horas Prion fluorescente após a infecção intraperitoneal

Resumo

Aqui nós descrevemos um ensaio de romance para o monitoramento e captação de prion tráfico por células do sistema imunológico imediatamente após a inoculação intraperitoneal de purificação e fluorescente rotulagem varas prion agregados de material cerebral infectado acompanhamento da sua absorção e movimento a partir do local da injeção e caracterizar as células mediadoras desses eventos.

Resumo

Presença de uma forma anormal de uma proteína prion host-codificado (PrPC) que é resistente à protease, patológicas e infecciosas caracteriza doenças de príon, como a doença crônica Wasting (CWD) de cervídeos e scrapie em ovinos. A hipótese de Prion afirma que esta conformação anormal constitui a maior parte ou todo o príon infeccioso. O papel do sistema imunológico em eventos precoces na patogênese da prion periféricos tem sido convincentemente demonstrada por CWD e ^1-3 scrapie. Transgênicos e farmacológicas estudos em ratos revelou um importante papel do sistema complemento na manutenção e replicando prions início após a infecção ^4-6. In vitro e in vivo estudos também observaram retenção de prion pelas células dendríticas ^10/07, apesar de seu papel no tráfico permanece claro ^11-16. Macrófagos têm igualmente sido implicados na patogênese da prion cedo, mas esses estudos concentraram-se em eventos que ocorrem semanas após a infecção ^3,11,17. Estes estudos anteriores também sofrem com o problema da diferenciação entre endógena PrP ^C e príons infecciosos. Aqui nós descrevemos uma abordagem imparcial semiquantitativo para avaliar a absorção de príon eo tráfico a partir do sítio de inoculação de células do sistema imunológico recrutados lá. Hastes prion agregados foram purificados a partir de homogenato de cérebro infectado por solubilização de detergente não agregados de proteínas e ultracentrifugação através de uma almofada de sacarose. Eletroforese em gel de poliacrilamida, coomassie coloração azul e recuperação de mata-borrão ocidental confirmados de varas prion altamente enriquecido na fração peletizada. Hastes príon foram fluorocromo marcado por via intraperitoneal, em seguida, injetadas em ratos. Duas horas mais tarde células imunológicas de lavado peritoneal, baço e gânglios linfáticos do mediastino e mesentéricos foram ensaiadas para a retenção de prion haste e subpopulações de células identificadas por multicolor citometria de fluxo utilizando marcadores para monócitos, neutrófilos, células dendríticas, macrófagos e células B e T. Este ensaio permite o monitoramento direto da primeira vez que células do sistema imunológico aquisição e prions tráfico in vivo dentro de horas após a infecção. Este ensaio também diferencia claramente infecciosas, prions agregadas de PrPC normalmente expressa em células do hospedeiro, que pode ser difícil e levar a problemas de interpretação de dados em sistemas de ensaio de outros. Este protocolo pode ser adaptado para outras rotas de inoculação (oral, intravenosa, subcutânea e intranervous, por exemplo) e antígenos (grânulos conjugados, patógenos bacterianos, virais e parasitárias e proteínas, o ovo) também.

Protocolo

1. Purificação e Rotulagem Rods Prion

Este protocolo foi adaptado de um ¹⁸ previamente publicados

1. Homogeneizar 100 gramas de prion infectados tecido cerebral em 900 mL de tampão de homogeneização gelada (HB, 1X PBS contendo sacarose 320 mM, 150 mM NaCl e 4 mM EDTA) 1 min na velocidade máxima em um liquidificador comercial, em seguida, 2 min no gelo. Repita três vezes.
2. Centrífuga homogeneizado por 10 min a 3000 xg e 4 ° C. Retire e guarde o sobrenadante no gelo. Re-suspender sedimento em 1L HB e repita os passos 1.1 e 1.2.
3. Sobrenadantes piscina e centrifugar por 60 min a 100.000 xg, 0 ° C. Elimine o sobrenadante.
4. Re-suspender pellet em 100 ml de 1X Tris salina tamponada (10 mM Tris-HCl, 0,1 mM NaCl e 1 mM EDTA) contendo 2% Triton X-100 (TBST). Concentração de proteína pela estimativa Bradford ou ensaios semelhantes e ajustar a 5 mg / mL em TBST. Frio no gelo por 30 min.
5. Centrifugar por 30 min a 100.000 xg, 0 ° C. Elimine o sobrenadante e lavar pellet com 50 TBST mL, em seguida, 100 mL TBS. Re-suspender pellet em 100 ml de 1X PBS contendo 1% sarcosyl e coquetel inibidor de protease e mexa por 120 min a 37 ° C.
6. Camada de amostra em 900 mL de 320 mM de sacarose e centrifugar por 60 min a 100.000 xg, 10 ° C. Elimine o sobrenadante e re-suspensão sedimento em 10 mL 2,3 M NaCl, sarcosyl 5%.
7. Sonicate amostra de 5 x 40 segundos na potência máxima de 70% em intervalos de 1 min no gelo.
8. ML de amostra de uma alíquota em tubos eppendorf e centrifugar por 15 minutos a 13.000 xg, 4oC. Lave duas vezes com TBS pellets e armazenar @ -70 ° C ou conjugado fluorocromo no passo 1.9.
9. Conjugado de um tubo de varas purificada prion usando 1 frasco de 649 DyLight fluorocromo de acordo com o protocolo do fabricante.
10. Troca de buffer rotulagem DyLight para PBS por diálise ou centrifugação através de colunas de filtro. Loja em 20 mL alíquotas a -70 ° C ao abrigo da luz até que esteja pronto para uso.

2. Inoculação príon celular e Recuperação

Esta seção abrange a inoculação intraperitoneal prion e recuperação de células do peritônio, linfonodos mediastinais e mesentéricos e baço.

1. Diluir varas prion fluorescentes 1:50 em PBS imediatamente antes da utilização. Rato Scruff pela pele do pescoço dorsal com o polegar eo dedo indicador, delicadamente por sua vez do mouse para enfrentá-lo e restringir cauda com pinky dedo. Supinate mouse, elevando o tronco traseiras acima da cabeça e segurando-o levemente de cabeça para baixo.
2. Usando uma seringa de insulina 30G, injectar 100 mL de varas prion fluorescente 1 cm lateral da linha média e 1-2 cm anterior à articulação sacroilíaca. Insira a agulha 1 centímetro através da pele direcionado 45 ° medialmente. Use 1:50 diluição de partículas fluorescentes ou sozinho PBS como controle. Incubar camundongos por tempo determinado antes da análise.
3. Euthanize ratos de acordo com o cuidado de animais aprovados e usam protocolos da comissão. Injectar 10 ml de PBS para a cavidade peritoneal, utilizando uma seringa e agulha 12 mL 25G. Agite levemente carcaça longitudinalmente para um minuto. Recuperar suspensão de células de peritônio usando a mesma seringa e uma agulha de 16G em um tubo cônico de 15 mL e reserva no gelo, enquanto a dissecação de carcaça continua.
4. Molhada no lado ventral da carcaça cuidadosamente com etanol 70%. Levante a pele na linha média logo abaixo da caixa torácica com uma pinça e corte uma pequena incisão através da pele com uma tesoura. A partir daí, fazer uma incisão centímetros 05/03 longa através da pele em ambos os sentidos a cabeça ea cauda, ​​em seguida, dois 2 cm de incisões lateralmente da linha média de cada extremidade. Retire a pele e pinos para revelar as cavidades peritoneal e torácica. Corte cuidadosamente através das membranas translúcidas finas ao redor do peritônio e refletem o tórax para revelar o mediastino.
5. Encontrar e remover 2-4 linfonodos mediastinais, ligeiramente dorsal e lateralmente adjacentes para o timo, medialmente adjacente à artéria braquiocefálica, perto do lado ventral da traquéia. Encontrar e remover até seis gânglios linfáticos mesentéricos, embutidos no tecido macio branco mesentérica, que ancora o intestino à parede abdominal posterior. Encontrar e remover o baço, um longo, vermelho escuro, órgão localizado apenas a lateral da linha média dorsal e para o intestino, no lado esquerdo do abdômen. Linfonodo de reserva em 1 mL RPMI 1640, em gelo até dissecção é completa.
6. Macerado e pressione gânglios linfáticos através de uma peneira de malha 40 mM em 3 mL de RPMI em uma placa de Petri de plástico usando o êmbolo de uma seringa de 1 mL. Enxágüe com um filtro de 2 mL de RPMI e transferir a suspensão celular 5 mL para um tubo cônico de 15 mL. Lavar a placa de Petri com um adicional de 5 mL de RPMI e transferência para o mesmo tubo. Centrifugar 5 minutos a 250 xg, elimine o sobrenadante, ressuspender o pellet celular em 1 mL FACS tampão (1X PBS, 1% de albumina bovina sérica e 10 mM EDTA) e transferir para um tubo Eppendorf 1,5 mL.

ove_title "Coloração> 3. Celular e Citometria de Fluxo

O seguinte é um protocolo de coloração típica para a identificação de subconjuntos de células imunes utilizando anticorpos fluorescentes contra bem caracterizados marcadores de superfície das células imunológicas. Todos os anticorpos foram diluídos em tampão FACS imediatamente antes da utilização.

1. Contagem de células e alíquota de 10 ⁶ células em tubos Eppendorf. Células de centrifugação (ver 2.7) e lavar pellet 2X com um tampão FACS mL.
2. Incubar as células 20 min no gelo em 100 mL de 2 ng / mL do mouse anti-rato CD16/32 para bloquear os receptores Fc endógena. Pellet e células de lavagem com tampão FACS.
3. Adicionar 100 mL de 1ng / mL apropriado anticorpos fluorescentes (y) s para cada amostra e incubar no gelo por uma hora. Adicionar 100 mL de tampão FACS sozinho para as células controle. Pellet e células lavar duas vezes com tampão FACS.
4. Re-suspender as células em 1 mL de tampão ACK (150 mM NH ₄ Cl, 1 mM KHCO ₃ e 0,1 mM EDTA) Incubar em gelo por 1 min para lisar as células vermelhas do sangue. Pellet e células de lavagem com tampão FACS. Re-suspender as células em um buffer de FACS mL.
5. Coletar dados a partir de células usando um citômetro de fluxo capazes de detecção e análise multicolor, tipicamente com 405, 488 e 633 nm de excitação e lasers 09:55 detectores de emissão de fluorescência.

4. Resultados representativos:

Nós purified varas prion de crude, prion infectados homogenato de cérebro (Figura 1) solubilização Detergente e ultracentrifugação dos alces E2 cérebro homogenato (faixas 1 e 2) grandemente enriquecido para hastes de prion (compare raias 1 e 3), que também foi protease K resistente (faixa 4). Curiosamente, não digerido varas prion purificada exibiu um perfil muito semelhante à glycoform homogeneizado digerida E2 cérebro, indicando enriquecimento dramático para príons. Homogenato de cérebro de forma idêntica tratados normais não produziu PK-resistente PrP ^C (faixas 5 e 6).

Análise de citometria de fluxo de populações de células específicas demonstram que as células apresentadoras de antígenos para casa para o peritônio em duas horas e reter partículas fluorescentes e barras de príon, como evidenciado por fluorescência aumentou dramaticamente ao longo controles PBS injetado (Figura 2). Não células colhidas do peritônio de PBS-tratados controles exibidos fluorescência acima de fundo (Figs. 2A-G), enquanto as células de talão (Figs. 2H-N) e prion (Figs. 2O-U)-inoculados camundongos exibido fluorescência significativa, especialmente em monócitos (Figs. 2I e P), células dendríticas (Figs. 2K e R) e macrófagos (Figs. 2L e S), e alguns neutrófilos (Figura 2J e Q) e menos células B (Figura 2T). Grânulo e Prion-rolamento monócitos, células dendríticas e macrófagos também foram encontrados nos gânglios linfáticos do mediastino duas horas após a inoculação (Figs. 2AD e AK, AF e AG e AM e AN, respectivamente), enquanto poucas ou nenhuma PrP ^CWD-bearing neutrófilos , as células B ou T foram encontradas lá (Figs. 2AE e AL, AH e AG e AI e AP, respectivamente). Nós não detectou contas ou varas príon no baço ou linfonodos mesentéricos (dados não mostrados). In totum, estes dados demonstram que o tráfego de células do sistema imunológico prions de forma muito semelhante aos antígenos de outras partículas.

REAGENT	Fluorocromo	LASER excitação (nm)	Pico de emissão (nm)
Hastes príon	DyLight 649	633	674
1 mM contas	AlexaFluor 660	633	685
Anticorpos
CD11b	eFluor 450	405	450
	Ficoeritrina-Cy7	488	760
CD11c	R-Ficoeritrina	488	575
	Ficoeritrina-Cy7	488	760
Ly6C	Fluoroisothiocyante	488	518
Ly6G	R-Ficoeritrina	488	575
CD21	DyLight 488	488	518
B220	Allophycocyanin-Cy7	633	785
CD3	R-Ficoeritrina	488	575

"> Tabela 1. Propriedades espectrais de reagentes fluorescentes

Figura 1. Purificação de varas prion de homogenato de cérebro infectado. Usamos um homogenato de cérebro de 10% bruto de um cervo CWD-infectados (E2, faixas 1 e 2) como matéria-prima da qual purificada varas prion agregado (faixas 3 e 4). Bruta e purificada materiais apresentaram resistência característica a protease K tratamento (faixas 1-4), enquanto homogenato de cérebro normal não (faixas 5 e 6). Marcadores de peso molecular são mostrados na Kd à esquerda da mancha. BH, homogenato de cérebro.

Figura 2. Citometria de fluxo imunológico prions tráfico células do peritônio para os gânglios linfáticos do mediastino duas horas após a inoculação. PBS (painéis AG e V-AB), partículas fluorescentes (HN e AC-AI) ou varas de Prion (OU e AJ-AP) foram injetado no peritônio de camundongos e células colhidas de lavado peritoneal (AU) ou linfonodos mediastinais (V-AP), duas horas mais tarde. Gráficos nas células primeira coluna show de camundongos tratados com PBS (painéis A e V), partículas fluorescentes (painel H e AC) e hastes de prion (painéis S e AJ). Células fluorescentes (pontos vermelhos ou verdes) e total de células (pontos cinza) são plotados para mostrar tamanho relativo de dispersão (para frente), granularidade de dispersão (lateral) e proporção do total de células vivas que apresentam fluorescência. Um número significativo de células característica de granulócitos retidos partículas fluorescentes e barras. Células também foram coradas com anticorpos contra marcadores de células imunes de superfície e fechado para LYG-Ly6C + monócitos (painéis B, I, P, W, AD e AK), Ly6c-CD11c-CD11b + Ly6G + neutrófilos (C, J, Q, X, AE e AL), Ly6G-Ly6C-CD11b + CD11c + células dendríticas (D, K, R, Y, AF e AM), Ly6G-Ly6C-CD11c-CD11b + macrófagos, (E, L, S, Z, AG e AN), CD3 -B220 + CD21 + células B (F, M, T, AA, AH e AO) e CD21-B220-CD3 + células T (G, N, U, AB, AI e AP). Monócitos, células dendríticas e macrófagos retidas partículas fluorescentes e barras de prion na cavidade peritoneal (painéis I e P, K e L e R e S, respectivamente) e transportou-os para os gânglios linfáticos do mediastino (painéis AD e AK, AF e AG e AM e AN, respectivamente), demonstrando absorção semelhantes e tráfico destas duas partículas. Neutrófilos retidos uma quantidade significativa de contas (J) e hastes menos (Q), mas não conseguiu entregá-los para os nódulos linfáticos (AE e AL). Células B retido e transportado algumas hastes (T e AO), mas praticamente nenhum contas (M e AH). Células T traficadas nem contas nem varas (N, U, AI e AP).

Discussão

Aqui demonstramos um protocolo para a marcação e rastreamento de prions in vivo que muito facilita o monitoramento de eventos no início de príons periféricos. Este protocolo aumenta muito em tentativas passadas de captação de prion de monitoramento in vitro ⁹ e in vivo ^3,12 por pré-inóculo rotulagem prion altamente enriquecido para diferenciá-lo de forma inequívoca endógena PrP ^C. Porque príons infecciosos e PrP ^C compartilhar a mesma seqüência de ác...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Cérebro de alce infectado por ECD	Fazenda privada de alces no Colorado		Utilize qualquer cérebro infectado por prion não humano
Processador de alimentos	Oster Professional Products	6694-015	Utilize qualquer processador de alimentos comercial
Centrífuga	Sorvall, Thermo Scientific	Rotor SS34	Utilize qualquer centrífuga/rotor capaz de atingir 3000 x g e suportar volumes ≥ 500 ml
Ultracentrífuga	Beckman Coulter Inc.	Rotor 50.2 Ti	Utilize qualquer ultracentrífuga/rotor capaz de atingir 100.000 x g e suportar volumes ≥ 500 ml
Reagente de Bradford	Sigma-Aldrich	B6916
Coquetel completo de inibidores de protease mini	Roche Group	11 836 170 001
Sonicador	Misonix	MP4000X	Utilize qualquer sonicador de ponteira ou de chifre ajustado a ~70% da potência máxima
Kit de marcação de anticorpos DyLight	Thermo Fisher Scientific, Inc.	53050
Microcentrífuga	Eppendorf	55430R	Utilize qualquer microcentrífuga refrigerada capaz de alcançar 13.000x g
Colunas de filtro centrífugo	EMD Millipore	Microcon YM-100	Utilize qualquer filtro ou membrana de diálise com corte de peso molecular de 100 Kd
Camundongos FVB com 8 a 40 semanas de idade	Charles River Laboratories	207	Utilize qualquer linhagem endogâmica de camundongo
Microesferas fluorescentes vermelhas de 1 μm	Phosphorex	2307	Utilize qualquer microesfera fluorescente ≤ 10 μm
Meio RPMI 1640	Invitrogen	11875-093
Peneira celular de 40 μm	Falcon BD	352340
Anticorpos fluorescentes	BD Biosciences	Vários	Utilize qualquer anticorpo fluorescente apropriado para sua aplicação.
Citômetro de fluxo	Dako	CyanADP	Utilize qualquer citômetro de fluxo capaz de detecção multicolorida de fluorescência