Monitoramento células imunes Tráfico Rods Horas Prion fluorescente após a infecção intraperitoneal

Resumo

Aqui nós descrevemos um ensaio de romance para o monitoramento e captação de prion tráfico por células do sistema imunológico imediatamente após a inoculação intraperitoneal de purificação e fluorescente rotulagem varas prion agregados de material cerebral infectado acompanhamento da sua absorção e movimento a partir do local da injeção e caracterizar as células mediadoras desses eventos.

Resumo

Presença de uma forma anormal de uma proteína prion host-codificado (PrPC) que é resistente à protease, patológicas e infecciosas caracteriza doenças de príon, como a doença crônica Wasting (CWD) de cervídeos e scrapie em ovinos. A hipótese de Prion afirma que esta conformação anormal constitui a maior parte ou todo o príon infeccioso. O papel do sistema imunológico em eventos precoces na patogênese da prion periféricos tem sido convincentemente demonstrada por CWD e ^1-3 scrapie. Transgênicos e farmacológicas estudos em ratos revelou um importante papel do sistema complemento na manutenção e replicando prions início após a infecção ^4-6. In vitro e in vivo estudos também observaram retenção de prion pelas células dendríticas ^10/07, apesar de seu papel no tráfico permanece claro ^11-16. Macrófagos têm igualmente sido implicados na patogênese da prion cedo, mas esses estudos concentraram-se em eventos que ocorrem semanas após a infecção ^3,11,17. Estes estudos anteriores também sofrem com o problema da diferenciação entre endógena PrP ^C e príons infecciosos. Aqui nós descrevemos uma abordagem imparcial semiquantitativo para avaliar a absorção de príon eo tráfico a partir do sítio de inoculação de células do sistema imunológico recrutados lá. Hastes prion agregados foram purificados a partir de homogenato de cérebro infectado por solubilização de detergente não agregados de proteínas e ultracentrifugação através de uma almofada de sacarose. Eletroforese em gel de poliacrilamida, coomassie coloração azul e recuperação de mata-borrão ocidental confirmados de varas prion altamente enriquecido na fração peletizada. Hastes príon foram fluorocromo marcado por via intraperitoneal, em seguida, injetadas em ratos. Duas horas mais tarde células imunológicas de lavado peritoneal, baço e gânglios linfáticos do mediastino e mesentéricos foram ensaiadas para a retenção de prion haste e subpopulações de células identificadas por multicolor citometria de fluxo utilizando marcadores para monócitos, neutrófilos, células dendríticas, macrófagos e células B e T. Este ensaio permite o monitoramento direto da primeira vez que células do sistema imunológico aquisição e prions tráfico in vivo dentro de horas após a infecção. Este ensaio também diferencia claramente infecciosas, prions agregadas de PrPC normalmente expressa em células do hospedeiro, que pode ser difícil e levar a problemas de interpretação de dados em sistemas de ensaio de outros. Este protocolo pode ser adaptado para outras rotas de inoculação (oral, intravenosa, subcutânea e intranervous, por exemplo) e antígenos (grânulos conjugados, patógenos bacterianos, virais e parasitárias e proteínas, o ovo) também.

Protocolo

1. Purificação e Rotulagem Rods Prion

Este protocolo foi adaptado de um ¹⁸ previamente publicados

1. Homogeneizar 100 gramas de prion infectados tecido cerebral em 900 mL de tampão de homogeneização gelada (HB, 1X PBS contendo sacarose 320 mM, 150 mM NaCl e 4 mM EDTA) 1 min na velocidade máxima em um liquidificador comercial, em seguida, 2 min no gelo. Repita três vezes.
2. Centrífuga homogeneizado por 10 min a 3000 xg e 4 ° C. Retire e guarde o sobrenadante no gelo. Re-suspender sedimento em 1L HB e repita os passos 1.1 e 1.2.
3. Sobrenadantes piscina e centrifugar por 60 min a 100.000 xg, 0 ° C. Elimine ....

Discussão

Aqui demonstramos um protocolo para a marcação e rastreamento de prions in vivo que muito facilita o monitoramento de eventos no início de príons periféricos. Este protocolo aumenta muito em tentativas passadas de captação de prion de monitoramento in vitro ⁹ e in vivo ^3,12 por pré-inóculo rotulagem prion altamente enriquecido para diferenciá-lo de forma inequívoca endógena PrP ^C. Porque príons infecciosos e PrP ^C compartilhar a mesma seqüência de ác.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Cérebro de alce infectado por ECD	Fazenda privada de alces no Colorado		Utilize qualquer cérebro infectado por prion não humano
Processador de alimentos	Oster Professional Products	6694-015	Utilize qualquer processador de alimentos comercial
Centrífuga	Sorvall, Thermo Scientific	Rotor SS34	Utilize qualquer centrífuga/rotor capaz de atingir 3000 x g e suportar volumes ≥ 500 ml
Ultracentrífuga	Beckman Coulter Inc.	Rotor 50.2 Ti	Utilize qualquer ultracentrífuga/rotor capaz de atingir 100.000 x g e suportar volumes ≥ 500 ml
Reagente de Bradford	Sigma-Aldrich	B6916
Coquetel completo de inibidores de protease mini	Roche Group	11 836 170 001
Sonicador	Misonix	MP4000X	Utilize qualquer sonicador de ponteira ou de chifre ajustado a ~70% da potência máxima
Kit de marcação de anticorpos DyLight	Thermo Fisher Scientific, Inc.	53050
Microcentrífuga	Eppendorf	55430R	Utilize qualquer microcentrífuga refrigerada capaz de alcançar 13.000x g
Colunas de filtro centrífugo	EMD Millipore	Microcon YM-100	Utilize qualquer filtro ou membrana de diálise com corte de peso molecular de 100 Kd
Camundongos FVB com 8 a 40 semanas de idade	Charles River Laboratories	207	Utilize qualquer linhagem endogâmica de camundongo
Microesferas fluorescentes vermelhas de 1 μm	Phosphorex	2307	Utilize qualquer microesfera fluorescente ≤ 10 μm
Meio RPMI 1640	Invitrogen	11875-093
Peneira celular de 40 μm	Falcon BD	352340
Anticorpos fluorescentes	BD Biosciences	Vários	Utilize qualquer anticorpo fluorescente apropriado para sua aplicação.
Citômetro de fluxo	Dako	CyanADP	Utilize qualquer citômetro de fluxo capaz de detecção multicolorida de fluorescência