Protocolo para produção de uma Cruz genética do parasita da malária de roedores

Técnicas de assepsia devem ser aplicados a todos os materiais que serão administrados em animais para evitar a introdução inadvertida de agentes infecciosos exógenos em camundongos que podem confundir os resultados experimentais.

1. Infecção de ratos de laboratório com sangue Parasitas estágio Malária

1. À temperatura ambiente, descongelar dois frascos contendo o sangue congelado parasitas da malária etapa a ser atravessada. Neste exemplo, duas cepas de roedores parasita da malária Plasmodium utilizados são yoelii yoelii e Plasmodium nigeriensis yoelii.
2. Fit uma seringa com uma agulha de calibre 22-30 (G) e elaborar 400 mL de estéril, de grau farmacêutico PBS (pH 7,4).
3. Usando a mesma seringa, elaborar 100 L de sangue descongelados infectados; inverter a seringa para cima e para baixo até que o conteúdo é homogeneamente misturados. (Opcional: uma pipeta pode ser usado para transferir PBS e sangue infectado em um tubo de coleta antes de transferir para uma seringa para injeção).
4. Injetar 200 mL contendo solução de parasita diretamente no peritônio de um mouse. Quando terminar, descarte a seringa em um recipiente para objectos cortantes. (Veja também materiais complementares para manutenção de ratos de laboratório). Em geral, o tamanho padrão do inóculo é entre 100-500 mL, dependendo dos níveis de infecção parasitária nos materiais originais congelados.
5. Injetar a duas cepas do parasita a ser atravessado em dois camundongos cada. Camundongos se tornará positivo microscopicamente 3 a 5 dias após as injeções. Parasitemias, quando chegar entre 1-5%, continue para a próxima etapa.

2. Infecção Clone misto de Ratos

1. Antes da infecção clone mista, coleta de sangue da cauda dos dois ratos doadores infectados com as cepas de parasitas diferentes para exame microscópico de esfregaços de sangue corados Giemsa fino (Fig. 3), e para a medição da densidade de células vermelhas do sangue (veja Materiais suplementares para as modalidades) .
2. Calcular o volume de um soro fisiológico (1,5% w / v citrato trissódico, 0,85% w / v de cloreto de sódio) e do sangue do mouse necessários para produzir uma mistura de inóculo, utilizando a parasitemia e vermelho sangue medições de densidade de células obtidas anteriormente.
3. Ajuste a solução de parasita para uma concentração final de um milhão de glóbulos vermelhos infectados por 100μl.
4. Combine o sangue infectado de dois doadores na proporção de 1:1 para obter um inóculo misto clone. Quando os dois clones parentais diferem em taxa de crescimento, ajustar as proporções de um. Mais rápido crescimento dos pais para um clone de crescimento mais lento dos pais para 1:2 ou 1:5
5. Injectar 100 mL da amostra misturada em peritônio de cada rato para ser infectado. (Ver também passo 3,9 para determinar o número de ratos a ser injetado)
6. Usando este método, infectar dois ratos, cada um com as cepas única parental. As infecções de um único clone vai permitir a determinação da transmissão de sucesso das duas estirpes parentais.

3. Os mosquitos alimentação

1. Prepare três gaiolas contendo 300-500 adultos (machos e fêmeas) Anopheles stephensi mosquitos cada, idade pós-emergência 5-7 dias a partir de pupas. Os recipientes são cobertos com panos seguro por um plástico ou tampa de metal. Duas gaiolas são para se alimentando de clones parental; a gaiola terceiro é para a preparação de um cruzamento genético.
2. Começando quatro dias após a infecção mista-clone, prepare Giemsa-manchada manchas cauda fina de sangue dos camundongos infectados.
3. Examine os esfregaços sob um microscópio de varredura por pelo menos 50 campos microscópicos, aumento de 1000x e determinar se gametócitos masculinos e femininos estão presentes.
4. Gametócitos masculinos e femininos são reconhecíveis, devido à presença de grandes grânulos vacúolo e grandes (Fig. 3). Gametócitos masculinos e femininos têm citoplasma rosa e azul, respectivamente. Se gametócitos estão presentes, siga passo 3.6.
5. Se gametócitos estão ausentes, manter acompanhamento diário até que eles apareçam. Se gametócitos estão presentes, continue o passo seguinte.
6. Injetar 50 mL de anestésico cocktail de drogas contendo 33 mg / mL de ketamina e 3 mg / mL de xilazina no peritônio de um rato para anestesiar cada rato infectado (por 20 gramas de peso corporal do rato). Última dose de quetamina e xilazina é 82,5 e 7,5 mg / Kg, respectivamente.
7. Coloque os ratos viradas para baixo no topo de uma gaiola contendo mosquitos adultos Anopheles stephensi que foram privadas de abastecimento de açúcar por 24 horas e permitir que os mosquitos se alimentam por 30 minutos sem interrupção.
8. Manter os mosquitos em um insetário sob condições padrão (temperatura é mantida entre 24-26 ° C; também ver Métodos complementares para a manutenção do laboratório de mosquitos).
9. Use um mouse infectados para cada 5-10 mosquitos fêmeas. Eutanásia os ratos imediatamente por deslocamento cervical após a alimentação, enquanto os ratos estão ainda sob anestesia.

4. Midg Mosquito dissecaruts e oocistos Contagem

1. Nove dias após a alimentação, os mosquitos serão examinados para oocistos no intestino médio do inseto. A presença de oocistos na mosquitos que se alimentam de um único clone camundongos infectados indica que gametócitos das duas estirpes parentais são infecciosos.
2. Para dissecar um intestino médio do mosquito, use um aspirador ligado a um pequeno recipiente para coletar 5-10 mosquitos infectados da jaula.
3. Usando gás CO _2, anestesiar os mosquitos e transferi-los para uma placa de Petri de vidro em gelo. Separar e descartar mosquitos machos. As antenas dos machos são visivelmente bushier em comparação com as fêmeas.
4. Preencher duas seringas com PBS e encaixá-los com 26 gauge de meia polegada (G ^½) agulhas. Depósito de cerca de 100 mL de PBS a partir de uma seringa numa lâmina de vidro.
5. Transferência 5-10 anestesiados mosquitos fêmeas para a gota de PBS e colocar o slide em um microscópio de dissecação.
6. Usando a mesma agulha, remova cada mosquito asas e pernas e, em seguida, mantendo o inseto no abdômen, tórax posterior e, puxe o corpo sem até que o intestino médio, um corpo de saco branco, é liberado. Destacar o intestino médio e descartar o resto do corpo.
7. Adicionar PBS mais no intestino médio se os slides estão secos. O intestino médio vão se degenerar se deixe secar. Coloque uma lamínula sobre o intestino médio.
8. Examinar o intestino médio em microscópio de luz com uma ampliação de 100x. Contar o número de oocistos em cada intestino médio (Fig. 3). Oocistos são reconhecidas como de espessura de parede estruturas circulares que se encontram na superfície externa dos intestinos.
9. Quando terminar, jogue de seringas, agulhas, e deslize em uma lata de farelos.
10. Se oocistos são ausentes no intestino médio, alimentar os mosquitos com camundongos infectados com o maior número de gametócitos e dar um tempo mais longo de alimentação. Temperatura é fundamental para esta etapa. Certifique-se que a temperatura é de 24 a 26 ° C.

5. Coleta de esporozoítos de mosquitos por centrifugação

1. Prepare tubos de coleta esporozoíto da seguinte forma: corte a tampa de um tubo de centrífuga de 0,5 mL limpo e faça um furo (0,1-0,2 mm de diâmetro) na parte inferior do tubo usando uma agulha G flamed 19.
2. Preencha 1 / 3 do tubo com lã de vidro. Insira o tubo de filtro para um tubo de coleta de 1,5 mL (um tubo é suficiente para colheita de esporozoítos ~ 100 mosquitos)
3. No dia da alimentação pós-17, coletar mosquitos (Etapa 4) das gaiolas em um pequeno frasco com um aspirador.
4. Uso do gás CO ₂ para anestesiar os mosquitos.
5. Separar as fêmeas dos mosquitos do sexo masculino. Transferir os mosquitos anestesiados feminino do recipiente para uma placa de Petri de vidro em gelo.
6. Prepare duas seringas com agulhas 26 G ^½ cheio de PBS. Depósito de cerca de 100 mL de PBS a partir de uma seringa numa lâmina de vidro.
7. Transferir os mosquitos em uma lâmina de microscópio. Retire a cabeça dos mosquitos, as asas, pernas e abdômen com um microscópio de dissecação.
8. Usando uma pinça de ponta fina transferir o tórax em 0,5 mL de PBS em um homogeneizador de 1,5 mL (pilão). Armazenar o tórax no gelo (esporozoíto permanece infectante por 2-3 h).
9. Homogeneizar o tórax no gelo para liberar esporozoítos das glândulas salivares (ver Figura 3), e transferir os lisados ​​(homogeneizados) para dentro do tubo preenchido com lã de vidro (Passo 5,1-5,2), utilizando uma pipeta de vidro.
10. Centrifugar por 10 a 20 segundos a 1000 rpm em temperatura ambiente.
11. Recolher o fluxo através de (a suspensão esporozoíto purificada) usando uma seringa com uma agulha G 22-30. (Opcional: queda de 10-50 mL do fluxo através de uma lâmina de microscópio, coloque uma tampa de deslizamento e visualizar os esporozoítos viver sob um microscópio de luz padrão, 400X ampliação, ver também Fig. 3)
12. Injetar 0,1-0,5 mL ip da suspensão esporozoíto em camundongos (até 200.000 parasitas podem ser colhidas a partir de um único mosquito, ver ref 12). Em um caso bem sucedido, o animal infectado 72 horas após a injeção.

6. Progeny clonagem usando diluição Limitada

1. Setenta e duas horas após as injeções esporozoíto, coleta de sangue da cauda dos dois ratos doadores infectados com as cepas de parasitas diferentes para exame microscópico após Giemsa coloração de sangue fino e para a medição da densidade de células vermelhas do sangue (veja Materiais suplementares para as modalidades).
2. Escolha um rato mostrando uma parasitemia 0,1 a 1% e cujos glóbulos vermelhos infectados contêm parasitas maioria simples como um doador para o procedimento de clonagem. Repita o passo 6,1 dia seguinte, se os ratos são microscopicamente negativo. Se os animais não estão infectados dentro de 14 dias, repita o Passo 2 a 5 e determinar a presença de esporozoítos no passo 5.11).
3. Diluir o sangue colhido da cauda em uma solução fria 1:01 de solução Ringer bezerro soro e mamíferos de (2,7 mM de cloreto de potássio, cloreto de cálcio 1,8 mM, 154 mM cloreto de sódio), de modo a atingir um conconcentração de 0,6 a 1 glóbulo vermelho infectado por 100 mL, e armazenar o inóculo no gelo. Desta forma, a maioria do mouse indivíduo deve receber um ou zero parasitas.
4. Por via intravenosa, injectar 100 mL de sangue infectado diluído em cada um dos 5-10 ratos.
5. Cinco a sete dias depois, a tela do camundongos para a presença de parasitas no sangue estágio examinando Giemsa-manchada esfregaços de sangue fina. Em um experimento bem sucedido, 20-50% dos camundongos infectados e mostrará parasitemia de 0,1-5,0% no dia após a infecção 8.

7. Caracterização da Progeny usando Marcadores Genéticos

1. Coletar 20-40 mL de sangue da cauda do rato em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL que contém 0,2 mL de solução de citrato refrigerados salina fisiológica, brevemente vortex e centrifugar por 3 min a 3000 rpm em temperatura ambiente para agregar as células do sangue. Extrair DNA imediatamente ou manter o pellet a -80 ° C.
2. Prepare DNA do parasita usando qualquer padrão de métodos de extração de DNA. Para o isolamento rápido de DNA, usar um modelo de alta Pure PCR preparação kit (Roche Applied Bioscience).
3. Progênie recombinante são identificados após genotipagem utilizando microssatélites (MS) ou polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) em cromossomos diferentes que podem diferenciar as duas estirpes parentais da cruz genética. Um método simplificado utilizando primers fluorescentes único marcado para MS genotipagem de P. yoelii pode ser utilizado (ver ref 8,9).

8. Criopreservação de parasitas da malária do sangue estágio

1. Coletar 0,5-1 mL de sangue infectado por punção cardíaca a partir de um rato anestesiado com parasitemia de 5-20% em 50-10 mL refrigeradas solução salina fisiológica.
2. Centrifugar por 5 min a 2000 rpm em temperatura ambiente. Elimine o sobrenadante.
3. Adicione gota a gota, o volume 2x de Glycerolyte solução 57 (Fenwal Laboratories) para pelotas de sangue e misture bem.
4. Transferir a suspensão para criotubos (0,2-0,5 mL por tubo).
5. Armazenar o sangue criopreservados a -80 ° C (até 1 mês) ou em nitrogênio líquido.

9. Resultados representativos:

Em uma experiência bem sucedida, 5-10% das linhas clonadas serão progênie recombinante independente.

Figura 1. A representação esquemática do ciclo de vida e eventos de recombinação genética durante um cruzamento genético. Eventos de recombinação genética ocorrem durante a fase inicial de desenvolvimento do mosquito. Após a fecundação de "haplóide" gametas masculinos e femininos de diferentes origens genéticas no intestino médio do mosquito, "diplóide" zigotos são formadas. O zigoto constitui a fase diplóide apenas do ciclo de vida do parasita; meiose segue dentro de 12 horas de fecundação, e todas as fases subsequentes do mosquito e mamíferos permanecem haplóides. Os zigotos resultantes desenvolver em ookinetes e oocistos. Crescimento e divisão mitótica de cada oocisto produz milhares de esporozoítos, que são liberados na hemoceal mosquitos. Os esporozoítos que migram para as glândulas salivares estão em posição de ser transmitido a um hospedeiro mamífero, onde o desenvolvimento do fígado e estágios de glóbulos vermelhos ocorre. Durante o curso dos ciclos de células vermelhas do sangue, alguns parasitas podem se diferenciar em madura gametócitos masculinos e femininos. O ciclo de vida do parasita se completa quando esses gametócitos são captados por um outro mosquito de transmissão, perpetuando.

Figura 2. Herança de genes nucleares em parasitas da malária e produção de progênie recombinante. Recombinação genética pode ser gerado através de rearranjo cromossômico ou por eventos crossover. Progênie homozigota produzido por autofecundação entre gametas de um mesmo clone parental 1 ou 2 (A e D), respectivamente. B) progênie heterozigóticas produzido por fertilização cruzada entre os gâmetas de dois diferentes clones dos pais, núcleos recombinante (ovais azuis) sendo formado por rearranjo cromossômico sozinho. C) progênie heterozigóticas produzido a partir de fertilização cruzada entre os gametas dos dois clones pai diferente, núcleos recombinante (ovais vermelho) sendo formada por crossovers entre as cromátides não-irmãs dos cromossomos homólogos.

Figura 3. Morfologia do parasita da malária Plasmodium roedores yoelii. A) fase de anel, B) trofozoíto, C) esquizonte, D) merozoítos, E) gametócitos macho imaturo, F) gametócitos maduros do sexo masculino, G) gametócitos femininos imaturos, H) gametócitos maduros do sexo feminino, I) do intestino médio com oocistos no post dia 10 alimentação (oocistos maduros indicado por setas; aumento de 200x), J) mosquito glândulas salivares (100x), K) esporozoítos (400x de ampliação).