Implantação de cânula na cisterna magna em um modelo de camundongo

Resumo

Fonte: Xavier, A. L. R., et al. Implantação de cânula na cisterna magna de roedores. J. Vis. Exp. (2018)

Este vídeo demonstra o procedimento para implantar uma cânula na cisterna magna de um camundongo anestesiado. A técnica envolve guiar uma cânula montada em agulha através da dura-máter até a cisterna magna triangular invertida e prendê-la para entrega direcionada no líquido cefalorraquidiano.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Procedimento cirúrgico
   NOTA: A canulação crônica da cisterna magna (MC) permite que os animais se recuperem do procedimento cirúrgico. As injeções de CM são feitas no dia seguinte ao implante da cânula e, mais importante, podem ser realizadas em animais anestesiados ou acordados. Por se tratar de uma cirurgia de recuperação, os procedimentos devem ser realizados em condições estéreis.
   1. Pese o camundongo (C57BL/6JRj, ambos os sexos, 8 semanas) e anestesieste-o com uma mistura de cetamina e xilazina (100 mg/kg; 10 mg/kg, respectivamente) por injeção intraperitoneal (i.p.). Se necessário, redose o camundongo com meia dose de cetamina (50 mg / kg) durante o procedimento cirúrgico. Alternativamente, para canulação crônica, anestesiar o camundongo colocando-o em uma câmara de indução de isoflurano a 2,5 - 3% de isoflurano, a cerca de 1 L / min de oxigênio (O₂). Nesse caso, use um cone nasal para manter a anestesia com isoflurano a 1,5 - 2% durante toda a cirurgia.
   2. Quando os reflexos de beliscar os dedos dos pés cessarem e a respiração se tornar lenta e constante, coloque o animal em uma estrutura estereotáxica sobre uma almofada de aquecimento.
   3. Aplique pomada oftálmica. Repita durante a cirurgia sempre que necessário.
   4. Raspe a cabeça e o pescoço do camundongo, remova o pelo e esterilize a pele exposta primeiro com um cotonete embebido em álcool e depois duas vezes com clorexidina (0,5%) ou solução de iodo (2%). Repita a esterilização mais duas vezes.
      NOTA: Troque o campo cirúrgico para remover detritos e cabelos após o barbear. Em seguida, coloque o animal para proteger o campo estéril.
   5. Para canulação crônica, administrar 0,5 - 1 ml de lidocaína/bupivacaína (1 mg/ml e 0,25 mg/ml, respectivamente) por via subcutânea (s.c.) no local da incisão. Administre buprenorfina (0,05 mg / kg; s.c.) para analgesia pós-cirúrgica.
   6. Fixe o mouse no quadro estereotáxico. Após garantir a fixação, seja intraaural ou pelo arco zigomático, incline levemente a cabeça para formar um ângulo de 120° em relação ao corpo (Figura 1E).
   7. Encontre a parte do crânio que se projeta imediatamente acima dos músculos do pescoço - a crista occipital. Levante a pele sobrejacente usando uma pinça e corte um pedaço de pele em forma de amêndoa de aproximadamente 1 cm ao longo da linha média. Use cotonetes ou lanças oculares para controlar qualquer sangramento resultante.
   8. Usando a crista occipital como ponto de referência, separe o tecido conjuntivo superficial para expor os músculos do pescoço abaixo.
   9. Separe os músculos na linha média passando cuidadosamente a pinça no meio do local da incisão no eixo anterior-posterior. Com um par de pinças curvas em cada mão, junte as pontas no meio perto da parte inferior do crânio e puxe os músculos para o lado.
      NOTA: Isso deve expor o MC, que aparece como um minúsculo triângulo invertido, delineado pelo cerebelo acima e medula abaixo, atrás da membrana dural translúcida (Figura 1B e 1C).
   10. Usando uma lança cirúrgica ou cotonete, limpe a membrana dural que cobre o MC.
2. Inserção da cânula no CM
   1. Remova a cânula da seringa cheia de líquido cefalorraquidiano artificial (aCSF), mantendo a agulha 30G presa à extremidade traseira do tubo.
   2. Conecte a agulha 30G a uma seringa de 100 μL cheia de água destilada conectada a uma bomba de seringa.
   3. Insira uma bolha de ar de aproximadamente 1 cm na cânula retirando o ar com o auxílio de uma bomba de seringa.
   4. Usando uma bomba de seringa, retire 12 μL do marcador de líquido cefalorraquidiano (LCR) desejado para a cânula.
   5. Segure a cânula, cheia com o marcador de LCR, perto da agulha coberta por tubo com um par de pinças curvas seguradas na mão dominante. Descanse o dedo médio da mão não dominante na barra auricular do lado oposto e segure-o firme para uso posterior como descanso para a cânula.
   6. Insira a cânula em um ângulo de 45° em relação à cabeça do mouse, passando para o centro do MC, identificado por seu aspecto triangular visto através da dura-máter. Evite qualquer penetração do cerebelo ou medula. Certifique-se de que a agulha seja inserida apenas a uma profundidade de 1 a 2 mm, como o ponto em que o chanfro esteja inteiramente sob a dura-máter. Solte a pinça que segura a cânula e deixe a cânula descansar na mão não dominante.
      NOTA: A extremidade chanfrada das agulhas dentárias exigirá a aplicação de alguma força para perfurar a membrana dural que cobre o MC.
   7. Se necessário, seque qualquer vazamento de LCR após a penetração usando uma lança ocular cirúrgica ou cotonetes.
   8. Aplique 2-3 gotas de cola de cianoacrilato na membrana dural ao redor da cânula. Adicione uma gota de acelerador de cola para curar a cola imediatamente. Cubra o crânio e a agulha com uma mistura de cimento dental (aproximadamente 0,5 mg) e cola de cianoacrilato (3 - 5 gotas). Imediatamente após, aplique uma gota de acelerador de cola para curar.

Resultados

Figura 1: Injeção de traçadores na cisterna magna. (A) Visão geral esquemática da cabeça e do cérebro do camundongo mostrando a localização da cisterna magna (MC) em relação ao cérebro e às estruturas cranianas. (B) Foto...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
SOPIRA carpule 30G 0,3 x 12 mm	Kulzer	AA001
Chlorhexidine 0,5% (digluconato de clorexidina)	Meda AS		http://www.meda.dk/behandlingsomrader/desinfektion/desinfektion-af-hud/klorhexidin-sprit-medic-05/
Cotonete com álcool 70% álcool isopropílico 30 x 60 mm	Vitrex Medical A/S	520213
Viskoese Oejendraeber Ophtha	Ophtha	145250
Aplicador de madeira, cotonete duplo (Ø aproximadamente, 4 - 5 mm, comprimento aproximadamente, 12 mm)	Heinz Herenz	1032018
Lanças de olho	Medicom	A18005
Kimtech Science lenços de precisão limpadores de tecido	Kimberly Clark Professional	5511
Loctite super cola de precisão 5 g	Loctite		http://www.loctite-consumer.dk/da/produkter/superglue-liquid.html
Acelerador Insta-Set CA	Bob Smith Industries	BSI-152
Pó de cimento dental	A-M Systems	525000
Solução salina tamponada com fosfato (PBS; 0,01 M; pH 7,4)	Sigma Aldrich	P3813
Ovalbumina, Alexa Fluor 647 conjugado	Thermo Fisher Scientific	O34784
DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindol) solução (1 mg/mL)	Thermo Fisher Scientific	62248
Dextran, fluoresceína, 3000 MW, aniônico	Thermo Fisher Scientific	D3305
Ketaminol Vet 100 mg/mL (cetamina)	Intervet International BV	511519
Rompin Vet 20 mg/mL (xilazina)	KVP Pharma + Veterinär Produkte GmbH	148999
Xylocain 20 mg/mL (lidocaína)	AstraZeneca	158543
Marcain 2,5 mg/mL (bupivacaína)	AstraZeneca	123918
Bupaq Vet 0,3 mg/mL (buprenorfina)	Richter Pharma AG	185159