Injeção de células progenitoras neurais fluorescentes em organoides cerebrais humanos para modelagem de transplante

Resumo

Fonte: Ibanez-Rios, M.I., et al., Um Modelo Organoide Cerebral Humano de Transplante de Células Neurais. J. Vis. Exp. (2023)

Este vídeo demonstra a injeção de células progenitoras neurais (NPCs) marcadas com fluorescência em organoides cerebrais humanos usando uma mistura de matriz celular. O método é reprodutível e livre de animais, permitindo o transplante com o mínimo de ruptura organoide. Ele oferece uma plataforma valiosa para modelar transplantes neurais e doenças do sistema nervoso central (SNC).

Protocolo

Todos os procedimentos que envolvem a coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.

1. Injeção de células rotuladas no organoide cerebral

NOTA: Para este artigo, os organoides cerebrais foram produzidos usando um kit comercial de acordo com as instruções do fabricante. Isso pode ser substituído pelo organoide cerebral de interesse. Os materiais utilizados nesta parte do protocolo devem ser pré-resfriados para evitar a gelificação da matriz da membrana basal solubilizada a temperaturas acima de 4 °C.

1. Coloque a(s) seringa(s), pontas e tubos de insulina que entrarão em contato com a matriz da membrana basal solubilizada a -20 °C para deixá-los esfriar.
2. Descongele uma alíquota de tamanho adequado da matriz da membrana basal solubilizada no gelo, dependendo do número de injeções que serão realizadas (~ 2 μL / injeção). Isso leva aproximadamente 30 minutos.
3. Enquanto a alíquota está descongelando, divida, colha e conte as células.
4. Calcule os volumes necessários por injeção. Se estiver fazendo várias injeções, coloque o volume total de células em um tubo de 1,5 mL e adicione até 1 mL de DMEM/F12.
   NOTA: Um volume que permita algumas injeções extras deve ser usado para contabilizar perdas/erros de pipetagem.
5. Coloque as células no gelo enquanto os próximos passos estão sendo preparados.
6. Após o descongelamento, diluir a matriz da membrana basal solubilizada até uma concentração final de 3 mg / mL em DMEM / F12 gelado.
7. Retire a suspensão de célula única do gelo e gire-a a 300 × g por 5 min a 4 °C.
   NOTA: Se uma centrífuga refrigerada não estiver disponível, a centrifugação à temperatura ambiente geralmente parece ser tolerada.
8. Remova suavemente o meio completamente sem perturbar o pellet celular. Ressuspenda o pellet celular pipetando suavemente na matriz da membrana basal solubilizada diluída (3 mg/mL) para obter um volume final de 2 μL por injeção a ser realizada e coloque-o imediatamente de volta no gelo até o uso.
   NOTA: A ressuspensão das células precisa ser realizada lentamente e com pontas pré-resfriadas para evitar a formação de bolhas e gelificação.
9. Transfira a(s) seringa(s) pré-resfriada do freezer a −20 °C para um balde de gelo. Mantenha-os lá até o uso.
10. Remova a placa com os organoides cerebrais da incubadora. Use uma ponta de furo largo para transferir o organoide a ser injetado em um prato de 35 mm. Remova todo o meio possível sem danificar o organoide para estabilizá-lo e facilitar a injeção.
    NOTA: É importante usar pontas de furo largo para evitar a destruição do organoide. Se eles não estiverem disponíveis, corte a ponta de uma ponta P1.000 normal com uma tesoura estéril.
11. Coloque o prato de 35 mm contendo o organoide sob um microscópio de dissecação para ajudar a guiar e facilitar a injeção.
    NOTA: Se um microscópio de dissecação não estiver disponível em uma área estéril, é possível realizar a injeção sem um, embora com controle um pouco reduzido. Outra alternativa é o uso de um laço de ampliação ou óculos.
12. Quando o(s) organoide(s) estiver(em) pronto(s) para ser injetado, ressuspenda suavemente as células com uma ponta de pipeta P20 resfriada e mova 2 μL (contendo o número desejado de células a serem injetadas) em uma lâmina de vidro estéril pré-resfriada.
    NOTA: Para várias injeções, um volume adicional de 2 μL pode ser adicionado através da lâmina de vidro. Mantenha-o no gelo e tome cuidado para evitar a evaporação.
13. Pegue uma seringa de insulina pré-resfriada do gelo e retire lentamente os 2 μL de suspensão celular com o chanfro da agulha voltado para baixo para permitir que todas as células/meio sejam absorvidas.
    NOTA: Certifique-se de ir muito devagar para evitar aspirar ar.
14. Abra a tampa do prato que contém o organoide e concentre o microscópio nele. Segure o prato com uma mão. Coloque o chanfro da agulha para cima e, com a outra mão, injete as células lentamente na superfície do organoide.
    NOTA: É importante injetar lentamente para evitar danos ao tecido.
15. Após a injeção, coloque a tampa de volta no prato e deixe o organoide injetado descansar por 1-2 min.
    NOTA: Isso permite que a matriz da membrana basal diluída e solubilizada gelifique, mantendo as células no lugar. Se o meio for adicionado muito cedo, ele pode lavar as células que ficam na superfície.
16. Adicione suavemente 500 μL do meio organoide e transfira o organoide com uma ponta larga para um poço de uma placa de 24 poços. Incubar o organoide a 37 °C e 5% de CO₂ durante a noite. Realize trocas completas de meio a cada dois dias.
    NOTA: É importante incluir um organoide de controle negativo (simulado), que será usado para ajustes de imagem. Para fazer isso, injete um organoide, conforme descrito anteriormente, com matriz de membrana basal solubilizada diluída (3 mg / mL) para obter um volume final de 2 μL sem células.

Materiais

< classe de figura='tabela'>< estilo col = 'largura: 25%;'>< estilo col = 'largura: 25%;'>< estilo col = 'largura: 25%;'>< estilo col = 'largura: 25%;'> Lista de materiais utilizados neste artigo Nome Empresa Número de catálogo Comentários DMEM F12 / GlutamaxThermo10565018 Matrigel Fator de Crescimento Reduzido (TFG)Corning356231Fenol Vermelho Livre, Livre de LDEV