Quantificando amilóides induzidos por infecção bacteriana usando fluorescência de tioflavina T

Resumo

Fonte: Balczon, R., et al. Métodos para detecção de amilóides citotóxicos após infecção de células endoteliais pulmonares por Pseudomonas aeruginosa. J. Vis. Exp. (2018)

Este vídeo demonstra o protocolo para quantificar amiloides em sobrenadantes de cultura de células endoteliais pulmonares infectadas com bactérias virulentas, usando tioflavina T, um corante fluorescente que se liga a estruturas de folha beta amilóide. Um aumento na fluorescência em comparação com a linha de base indica a presença de amiloides no sobrenadante da cultura.

Protocolo

1. Análise de sobrenadantes citotóxicos

1. Para fazer um ensaio de tioflavina T (ThT), use a fluorescência ThT para quantificar os amilóides em sobrenadantes. Para essas medições, use sobrenadantes esterilizados por filtro.
   1. Prepare uma solução estoque (50x) de ThT suspendendo 8 mg de ThT em 10 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS). Após a mistura, filtrar a solução através de um filtro de 0,22 μm para remover as partículas.
   2. Para medições, adicione 20 μL de estoque ThT a 1 mL de PBS em uma cubeta de espectrofotômetro de 1 mL. Colocar a amostra diluída num espectrofluorómetro.
   3. Meça a emissão de fluorescência de linha de base usando excitação de 425 nm e varrendo a emissão de fluorescência de 450-575 nm em incrementos de 2 nm.
   4. Execute uma varredura de lapso de tempo usando excitação de 425 nm e emissão de 482 nm, com dados adquiridos a cada 0.2 s por 60 s.
   5. Os 20 s iniciais da varredura de lapso de tempo medem a fluorescência na cubeta em branco. A 20 s, pause a varredura e adicione 10 μL do sobrenadante esterilizado por filtro à cubeta. Misturar a cubeta por inversão e colocá-la de volta no espectrofluorómetro.
   6. Retome a verificação baseada em tempo, adquirindo os 40 s finais de dados.
   7. Após a conclusão da varredura de lapso de tempo, execute uma varredura final do espectro de emissão de fluorescência usando configurações idênticas, conforme detalhado na etapa 1.3.

Materiais