Ensaio de Coincubação para Estudo de Interações Competitivas entre Cepas Bacterianas

Resumo

Fonte: Speare, L., et al. Ensaio de Coincubação para Quantificar Interações Competitivas entre Isolados de Vibrio fischeri . J. Vis. Exp. (2019)

Este vídeo demonstra um ensaio de co-incubação usado para estudar como as cepas bacterianas competem em um ambiente compartilhado. É amplamente aplicado em microbiologia para identificar mecanismos, como morte dependente ou independente de contato, que impulsionam essas interações.

Protocolo

1. Cepas de Coincubação (Figura 1B, C)
   1. Misture a cepa de referência e a cepa concorrente em uma proporção de 1:1 (v/v) adicionando 100 μL de cada cepa (normalizada para OD 1,0) a um tubo de centrífuga rotulado de 1,5 mL. Como controle, misture a cepa de referência com uma versão marcada diferencialmente de si mesma (cepa de referência pVSV102 + cepa de referência pVSV208). Este controle é necessário para análise estatística posterior para determinar se a presença de uma cepa concorrente afeta o crescimento da cepa de referência. Vortex a cultura de cepas mistas por 1-2 s.
      NOTA: Esta etapa pode exigir otimização, pois a taxa inicial pode afetar significativamente os resultados e pode precisar ser ajustada.
   2. Repita a etapa 1 para cada réplica biológica. Após a conclusão desta etapa, deve haver um total de oito tubos de cepas mistas: quatro réplicas biológicas com cepas de referência marcadas diferencialmente (controle) e quatro réplicas biológicas com cepas de referência e concorrentes marcadas diferencialmente (experimental).
   3. Localize 10 μL de cada mistura controle e experimental em placas de Petri contendo ágar LBS; Esses pontos de cultura serão usados para microscopia de fluorescência após a incubação.
   4. Deixar secar completamente as manchas na bancada até que todo o líquido tenha sido absorvido pelo ágar e incubar as placas de Petri a 24 °C durante 24 h. Um mínimo de 15 h é necessário para que as cepas de V. fischeri marcadas com pVSV102 e pVSV208 cresçam até uma densidade celular alta o suficiente para visualizar a proteína fluorescente verde (GFP) e a proteína fluorescente vermelha (RFP), respectivamente, no nível da população usando um microscópio de dissecação de fluorescência. Aqui, usamos uma incubação de 24 horas para obter imagens de manchas mistas.
      NOTA: É importante usar placas que não sejam muito úmidas ou muito secas. Se as placas estiverem muito úmidas, os pontos de incubação não serão absorvidos pela placa de ágar; Evite usar pratos servidos no mesmo dia. Se as placas estiverem muito secas, pequenas ondas ou rachaduras podem se formar na superfície do ágar, tornando as manchas de coincubação irregulares.

Resultados

Figura 1: Fluxograma ilustrando o ensaio de coincubação. (A) As cepas bacterianas que abrigam pVSV102 (cepa de referência indicada Ref. Cepa ou RS) ou pVSV208 (cepa concorrente indicada Comp. Cepa ou CS) são cultivadas separadamente...

Materiais