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1. Ensaio de chapeamento
NOTA: O ensaio de plaqueamento mede a concentração de células capazes de gerar uma unidade formadora de colônias (UFC) nas amostras de cultura. Este procedimento revela a taxa na qual uma célula se divide em duas células viáveis e permite a detecção de paradas por divisão celular (por exemplo, um aumento no tempo de geração bacteriana da lise celular).
- Preparar diluições seriadas de 10 vezes até 10-7 dos 200 μl de amostra de cultura em meio fresco. Placa 100 μL da diluição apropriada em placas de agarose Luria-Bertani (LB) não seletivas para obter entre 3-300 colônias após incubação noturna a 37 ° C.NOTA: A diluição em série em meio fresco deve ser realizada rapidamente para limitar as divisões bacterianas. Alternativamente, os pesquisadores podem considerar o uso de uma solução salina sem fonte de carbono para evitar divisões celulares durante o processo de diluição.
- No dia seguinte, contar o número de colônias para determinar a concentração de células viáveis (UFC/mL) em cada amostra de cultura. Representar graficamente as UFC/ml em função do tempo para as culturas de células não tratadas e tratadas.
2. Citometria de fluxo
NOTA: A seção a seguir descreve a preparação de amostras de células para análise por citometria de fluxo. Esta técnica de análise revela a distribuição do tamanho celular e do conteúdo de DNA para um grande número de células. Sempre que possível, recomenda-se o processamento imediato das amostras de citometria de fluxo. Alternativamente, as amostras podem ser mantidas no gelo (por até 6 h) e analisadas simultaneamente no final do dia, uma vez que o plaqueamento e a microscopia tenham sido realizados.
- Dilua os 250 μL de amostra de cultura para obter 250 μL a uma concentração de ~ 15.000 células / μL (correspondendo a um OD600nm ~ 0,06) em meio fresco a 4 ° C.
NOTA: A incubação no gelo limitará o crescimento e a modificação morfológica das células. Alternativamente, o usuário pode considerar a realização da fixação das células em etanol a 75%, como geralmente é recomendado para citometria de fluxo. - Para coloração de DNA, misture a amostra bacteriana com uma solução de 10 μg/mL de corante fluorescente de DNA (proporção 1:1) e incube no escuro por 15 minutos antes de analisar a amostra.
- Passe a amostra para o citômetro de fluxo com uma taxa de fluxo de ~ 120.000 células / min. Adquira luz espalhada para frente (FSC) e espalhada lateralmente (SSC), bem como sinal de fluorescência de corante fluorescente de DNA (FL-1) com as configurações apropriadas.
- Plote os histogramas de densidade celular FSC e FL-1 para representar a distribuição do tamanho da célula e do conteúdo de DNA na população de células.