Evolução adaptativa de bactérias usando um sistema de cultura de microgotículas microbianas

Resumo

Fonte: Jian, X., et al., Cultivo Microbiano Automatizado e Evolução Adaptativa usando o Sistema de Cultura de Microgotículas Microbianas (MMC). J. Vis. Exp. (2022).

Este vídeo demonstra o uso de um sistema de cultura de microgotículas microbianas para impulsionar a evolução adaptativa das bactérias em direção à tolerância ao metanol. Ao misturar culturas bacterianas modificadas com um meio de estresse de alto teor de metanol e segmentá-las em microgotículas, o sistema seleciona mutantes que exibem crescimento aprimorado sob estresse de metanol. Por meio de ciclos de enriquecimento iterativos e isolamento de colônias, cepas bacterianas adaptadas ao metanol são cultivadas para análise ou aplicação posterior.

Protocolo

Evolução adaptativa em MMC

1. Preparação para a solução bacteriana inicial
   1. Siga os regulamentos padrão relacionados para preparar o meio líquido especial e as placas sólidas para o MeSV2.2 e autoclave a 121 °C por 15 min.
   2. Cultive o MeSV2.2 usando a placa sólida (diâmetro = 90 mm) em uma incubadora de temperatura constante a 37 °C por 72 h. Em seguida, escolher uma colónia independente e cultivá-la num balão agitado de 50 ml com 10 ml do meio líquido especial numa incubadora agitável (200 rpm) a 37 °C durante 72 h.
   3. Diluir a solução cultivada de MeSV2.2 com o meio até um OD₆₀₀ de 0,1-0,2 (garantir que o volume total não seja inferior a 10 ml) e continuar a cultivá-la no balão agitado durante 5 h para obter a solução bacteriana inicial.
      NOTA: O MeSV2.2 é uma cepa de E. coli essencial ao metanol. O meio líquido especial contém 500 mmol / L de metanol, o que é um forte estresse para o MeSV2.2, resultando em um crescimento muito lento.
2. Inicialize o MMC.
3. Retire dois frascos de reagentes esterilizados, um dos quais é para a solução bacteriana inicial e o outro é para o meio fresco. Injete a solução bacteriana inicial (5 mL), meio fresco (12-15 mL) e óleo MMC nos frascos de reagente.
   NOTA: Como a evolução adaptativa é um processo de longo prazo que envolve vários subcultivos, armazene o máximo possível de meio fresco no MMC. O meio não pode ser reabastecido durante o experimento.
4. Instale os dois frascos de reagente no MMC. Instale o da solução bacteriana inicial entre o conector C2 e O2 e o outro do meio fresco entre o conector C4 e O4.
5. Clique em ALE para escolher a função de evolução adaptativa (Figura 1B). Na interface de configuração de parâmetros, ligue a chave de detecção de OD.

6. Defina o número como 50, o comprimento de onda como 600 nm, a concentração como 0%, o tipo como tempo, o parâmetro como 30 h e as repetições como 99. Clique em Iniciar para iniciar a geração de droplets. Levará cerca de 25 minutos.
   NOTA: Aqui, "Concentração" refere-se à concentração máxima de fatores químicos para a evolução adaptativa. Para diferentes gotículas, é realizável em MMC introduzir diferentes concentrações de fatores químicos para fornecer diferentes condições de crescimento. Calcular as concentrações introduzidas utilizando a seguinte equação:

   

   Aqui, "C" refere-se à concentração de fatores químicos introduzidos nas gotículas; "a" refere-se à concentração de fatores químicos nos frascos de reagentes entre o conector C4 e O4; "b" refere-se à concentração de fatores químicos nos frascos de reagentes entre o conector C6 e O6; e "i" refere-se à concentração disponível. Existem oito concentrações disponíveis no MMC. Como o fator químico aqui tem uma única concentração (500 mmol/L de metanol) e é um dos ingredientes do meio, apenas um frasco de reagente contendo o fator químico é instalado aqui, e a concentração é definida como 0%. Tipo refere-se ao modo de subcultivo, que é dividido em três tipos: modo de tempo, modo de valor OD e modo de fluorescência. O primeiro significa cultivar as gotículas por um tempo fixo e depois subcultivar, enquanto os dois últimos significam cultivar as gotículas até um valor OD / intensidade de fluorescência predefinido e, em seguida, subcultivar. Parâmetro refere-se ao parâmetro relacionado necessário ao escolher um modo de subcultivo. As repetições referem-se ao número de subcultivos.

7. Remova o frasco de reagente colocado entre os conectores C2 e O2.
8. Observe se os valores máximos de DO das gotículas durante cada período de subcultivo aumentaram significativamente. Se o aumento ocorrer e atender aos requisitos do experimento, clique no botão Exportação de dados para exportar os dados OD.
   NOTA: Aqui, o período de subcultivo depende do parâmetro. Por exemplo, ao definir Tipo como Tempo e Parâmetro como 30 h, o período de subcultivo é de 30 h. Durante cada período de subcultivo, existem valores máximos de DO das gotículas. Estimar se a evolução adaptativa atende aos requisitos do experimento pelo aumento dos valores máximos de OD (O aumento depende do processo de cultivo real da cepa, por exemplo, aumentado em mais de 20%). CUIDADO: Preste atenção se o meio fresco armazenado está esgotado. Se o aumento significativo não ocorreu mesmo após o esgotamento do meio, extraia as gotículas de melhor crescimento e realize uma nova rodada de evolução adaptativa.
9. Extraia as gotículas alvo do MMC.
   1. Clique no botão Triagem para escolher a função de extração de gotículas (Figura 1C). Escolha a opção Coletar, clique no número de droplets de destino e, em seguida, clique em OK.
      NOTA: A triagem de gotículas inclui "Coletar", "Descartar" e "Extrair solução de sementes". "Extrair solução de sementes" significa coletar as gotículas restantes após a operação de subcultivo.
   2. Aguarde até que a janela pop-up avise: "Retire o conector rápido CF e coloque-o no tubo EP". Coloque o conector rápido CF no tubo da microcentrífuga para coleta de acordo com o prompt do software e clique em OK (Figura 2D).
   3. Após 1-2 minutos, a interface do software exibirá uma nova janela solicitando: "Insira o conector de volta e clique em OK se terminar". Em seguida, insira o conector rápido CF de volta e clique em OK para fazer o MMC continuar a funcionar (Figura 2D).
      NOTA: Depois que todas as gotículas alvo forem coletadas, o MMC continuará cultivando as gotículas restantes. Se o cultivo não for necessário, clique em Parar para encerrar diretamente a operação.
   4. Extrair a gota com uma pipeta de 2,5 μL, colocá-la na placa de agarose de 90 mm e espalhá-la uniformemente com uma haste de espalhamento de vidro triangular com um comprimento lateral de 3 cm. Em seguida, cultive-o em uma incubadora de temperatura constante de 37 °C por 72 h.
   5. Escolher 3-5 colónias independentes e cultivá-las separadamente nos balões agitados de 50 ml com 10 ml de meio fresco numa incubadora agitável (200 rpm) a 37 °C durante 48-72 h. Siga os regulamentos padrão relacionados para armazenar a solução de bactérias cultivadas no tubo de glicerol para experimentos subsequentes.

Resultados

Figura 1: Interface do software de operação do MMC. (A) A interface principal do software. (1) Temperatura na câmara de operação. (2) Valor do sinal fotoelétrico do reconhecimento de gotículas. Quando a gota passa, o va...

Materiais